آشنایی با بررسی سیکل سلولی به روش فلوسایتومتری

روش فلوسایتومتری یکی از روش هایی است که در طول چهار دهه گذشته تمام تلاشش را به کار گرفته تا آن گونه که باید و شاید بهبود پیدا کند. این روش که هرچه از کاربردهای فوق العاده اش برایتان بگوییم، حق مطلب را ادا نکرده ایم؛ تجزیه و تحلیل بهتر سیکل سلولی در شرایط مختلف فیزیولوژیکی را امکان پذیر می سازد. تمرکز اصلی این روش بر اهداف مهمی همچون DNA سلول به منظور ردیابی پیشرفت سیکل سلولی است. حتما می پرسید سیکل سلولی چیست و بررسی آن از طریق روش فلوسایتومتری چگونه قابل انجام است؟

آشنایی با سیکل سلولی

سیکل سلولی که از آن تحت عنوان چرخه سلولی نیز یاد می کنند، یکی از مهم ترین نکاتی است که آشنایی با آن به منظور شناخت روش فلوسایتومتری الزامی می باشد. تقسیم سلولی با مجموعه ای از نقاط چک و بررسی به نام چرخه یا سیکل سلولی اتفاق می افتد. سیکل مذکور 4 مرحله اصلی دارد:

• فاز (G1)
• سنتز (S)
• فاز (G2)
• فاز میتوزی (M)

هر یک از مراحل سیکل سلولی دارای نقش های متمایزی هستند. در مرحله اول که فاز (G1) نام دارد؛ سلول برای سنتز DNA آماده می شود. در مرحله دوم که سنتز (S) نامیده می شود، سنتز DNA اتفاق می افتد. این مرحله به ایجاد سلول هایی با سطح بالای DNA منتهی می گردد. پس از این مرحله، سلول وارد فاز (G2) شده و برای میتوز آماده می شود. پس از ورود به فاز میتوزی (M) به دو سلول دختر جداگانه تقسیم می گردد.

مدیریت پیشرفت در چرخه سلولی بر عهده کینازهای وابسته به سایکلین و کمپلکس های سایکلین است. سایکلین ها پروتئین کینازهایی هستند که در قسمت های ویژه ای از سیکل سلولی فعال می گردند. در صورتی که سایکلین ها فعال نشوند، ورود به فاز میتوزی و انجام فرایند میتوز غیر ممکن خواهد بود. با این اوصاف می توان نتیجه گرفت که تنظیم سیکل سلولی تا حد قابل توجهی به سایکلین ها و فسفوریلاسیون آن ها بستگی دارد.

معرفی روش فلوسایتومتری

به عنوان یکی از متداول ترین و اساسی ترین کاربردهای روش فلوسایتومتری که روشی شناخته شده با بازدهی فوق العاده است، می توان به تجزیه و تحلیل سیکل سلولی اشاره کرد. موفقیت های مثال زدنی این روش در بررسی سیکل سلولی موجب شده که روش فلوسایتومتری با سرعت غیر قابل باوری گسترش پیدا کند. این تکنیک و تکنیک های مشابه آن بر یک اصل تمرکز دارند و آن هم چیزی نیست جز: کمی کردن اجزای درون سلولی نظیر DNA و مولکول های متابولیک مربوط به سیکل سلولی همچون سایکلین ها.

برخی از تکنیک های بررسی سیکل سلولی تک متغیره می باشند. حتما می پرسید تک متغیره بودن این تکنیک ها به چه معناست؟!

تک متغیره بودن این دسته از تکنیک های بررسی سیکل سلولی به این معناست که آن ها تنها بر اندازه گیری محتوای DNA متمرکز هستند. در ابتدای این امر به آماده سازی سلول ها با رنگ فلورسنت می پردازند. رنگ فلورسنت استفاده شده در این مرحله را به سلول ها یا هسته های منفرد نفوذ پذیر می افزایند. یکی از رایج ترین رنگ های فلورسنت که می تواند اسید نوکلئیک را هدف قرار دهد، پروپیدیوم یدیدی (PI) نام دارد. رنگ مذکور به DNA وصل می شود. در طی پیاده سازی روش فلوسایتومتری، DNA متصل به این رنگ به انتشار یک سیگنال فلورسنت می پردازد. هر چه غلظت DNA بیشتر باشد؛ فلورسانس ساطع شده از سلول بیشتر خواهد بود. به عبارت کلی تر؛ میزان فلورسانس ساطع شده از سلول تابع مقدار DNA موجود بوده و در تمام شرایط یکسان نیست. به همین دلیل است که امکان جدایی فازهای G2 و میتوزی به هیچ عنوان میسر نمی باشد. دلیلش را گرفتید یا مجدد بازگو کنیم؟!

به دلیل این که دارای محتوای سلولی مشابهی هستند. ایراد روش فلوسایتومتری این است که گاهی محتوای DNA دو سلول را اشتباها به جای محتوای DNA یک سلول، شناسایی می کند و این دردسرها را پدید می آورد. شاید برایتان جالب باشد بدانید که این اشتباه اسم هم دارد و به عنوان یک پدیده هم شناخته می شود!

پدیده ای که در طی آن فلوسایتومتری دو سلول با محتوای DNA معمول فاز G1 را با یک سلول منفرد با محتوای DNA معمول فاز G2 یا فاز M اشتباه می گیرد؛ پیدا کردن دوتایی نامیده می شود. خُب به نظرتان تاوان این اشتباه چیست؟!

اشتباه مگر تاوانی جز جبران هم دارد؟! پس روش فلوسایتومتری هم در صدد جبران برآمده و فلوسایتومترهایش را به ماژولی که قادر به تشخیص دوگانه است، مجهز نموده است. این ماژول که با نام ماژول تفکیک دوگانه شناخته می شود، سلول های منفرد را بر مبنای داده های پردازش شده با پالس انتخاب می کند.

قضیه داده های پردازش شده با پالس چیست؟!

داده های پردازش شده با پالس به دسته ای از داده ها اطلاق می شوند که از فلورسانس منتشر شده از رنگ های متصل به DNA به دست می آیند. این داده ها می توانند ضمن اندازه گیری شدت فلورسانس ساطع شده، ناحیه پالس و عرض پالس نمونه را نیز به نمایش درآورند. ترسیم عرض پالس نمونه در مقابل ناحیه زمینه ای را فراهم می سازد که ماژول بتواند دوتایی های G1 را از تک سلول های G2/M متمایز سازد.

آشنایی با داده های حاصل از فلوسایتومتری

داده های حاصل از روش فلوسایتومتری به روش های متعدد و متنوعی قابل نمایش هستند. در ادامه هر یک از این روش ها را معرفی و به اختصار مورد بحث و بررسی قرار می دهیم.

هیستوگرام

هیستوگرام ها که غلظت نهایی رنگ را آنگونه که حق مطلب را ادا کند، ارائه می دهند؛ تنها قادر به نمایش یک پارامتر از نمونه هستند. هیستوگرام ها دارای یک ضریب تنوع تحت عنوان CV می باشند. میانگین فلورسانس و ضریب مذکور گزینه ای ایده آل برای بررسی های کمی فلوسایتومتری است.

نمودار نقطه ای

نمودارهای نقطه ای وظیفه نمایش دو بعدی داده ها را بر عهده دارند. هر سلول روی این نمودارها به شک یک نقطه نشان داده می شود. از همین رو این نمودارها را به منظور ارزیابی های اولیه و تعریف حدبندی مورد استفاده قرار می دهند.

کانتور

نمایش داده ها در این نمودار نیز درست مانند نمودارهای نقطه ای به صورت دو بعدی می باشد. این دسته از نمودارها در مقایسه با نمودارهای نقطه ای حالات بهتری از ارزیابی را برای محققان امکان پذیر می سازند.

کاربردهای روش فلوسایتومتری

استفاده از روش فلوسایتومتری در کلیه شاخه های علوم زیستی رایج می باشد. از این روش برای اندازه گیری ویژگی ها، مشخصه ها و حتی دسته بندی سلول ها اعم سلول های جانوری، گیاهی، باکتری ها، مخمرها، کروموزوم ها و میتوکندری ها استفاده می کنند. به کارگیری این روش در تشخیص بیماری ها و جداسازی سلول های اختصاصی با هدف درمان بیماری از دیگر کاربردهای آن در کلینیک ها می باشد. به کمک این تکنیک که جزء تکنیک های زیستی با بازدهی بالاست، می توان به اندازه گیری پارامترهای زیر پرداخت:

• اندازه گیری اجزای داخل سلولی نظیر DNA
• بیان آنتی ژن های سطحی
• بررسی فعالیت آنزیم های درون سلولی
• اندازه گیری PH درون سلولی
• …

مزایا و معایب روش فلوسایتومتری

به عنوان یکی از مهم ترین مزایای روش فلوسایتومتری که موجب محبوبیت آن در میان محققان شده، می توان به امکان اندازه گیری و بررسی پارامترهای مختلفی همچون پارامترهای زیر اشاره کرد. آن هم نه در یک سلول، بلکه در هزاران سلول و تنها در عرض چند دقیقه!

• اندازه سلول
• گرانولیتی
• ویژگی های درونی سلول
• میزان فلورسانس

روش مذکور عملیات فوق الذکر را با استفاده از یک سیستم دوگانه نوری- الکترونیکی انجام می دهد. دستگاهی که قادر به ضبط و ذخیره پراکنش نور لیزر به وسیله ذرات و یا فلورسانس ساطع شده از آن هاست.

عمده ترین ایراد روش فلوسایتومتری این است که تنها برای سلول های منفرد قابل استفاده بوده و نمی تواند به تجزیه و تحلیل ارتباط سلول ها در حالت فضایی بپردازد. لازم به ذکر است که این ایراد به هیچ عنوان نتوانسته از محبوبیت و کارایی این روش کاسته و باعث برتری سایر روش ها بر آن شود.