راهنمای جامع انجام تکنیک RT-PCR

تکنیک RT-PCR که مخفف شده Real Time Polymerase Chain Reaction نوعی روش تکثیر ژنتیکی محسوب می شود. این تکنیک در راستای تکثیر یک قطعه خاص از DNA در مقیاس کوچک مورد استفاده قرار می گیرد. جالب است بدانید که این روش به طور همزمان مقدار DNA مورد مطالعه را اندازه گیری می کند. آن هم با دقتی که شگفت زده تان می کند!

آنچه تا بدین جا گفتیم، چکیده ای بسیار مختصر از مبحث بسیار گسترده RT-PCR است. اگر از همین ابتدا شوق آشنایی با این تکنیک کاربردی وجودتان را فرا گرفته، باید بگوییم که جای خوبی آمده اید. ما این مبحث را با عشق برای شما تدارک دیده ایم. امید است که به کارتان بیاید!

آشنایی با واکنش زنجیره ای پلیمراز؛ پیش نیاز معرفی RT-PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز نام قلمبه سلمبه PCR می باشد که حتما در اختصار RT-PCR چشمتان را گرفته است. این پی سی آرِ پر ماجرا یک تکنیکِ کارآمدِ وابسته به دما برای تکثیر اسید نوکلئیک محسوب می شود. تکنیک مذکور را در شرایط آزمایشگاهی آنزیمی با هدف تکثیر DNA یا RNA پیاده سازی می کنند.

تکنیک RT-PCR نوعی PCR است که به سنجش توالی تکثیر شده به صورت کمی می پردازد. بدین منظور از یک دستگاه Real Time PCR که نوعی ترمال سایکلر دارای یک سیستم اپتیکی است، استفاده می کنند. این دستگاه به محاسبه میزان DNA موجود در هر نمونه می پردازد.

ماجرای رنگ ها در تکنیک RT-PCR چیست؟

در تکنیک RT-PCR از مجموعه ای از رنگ ها استفاده می شود. هنگامی که این رنگ ها به ساختار دو رشته ای DNA متصل می شوند، یک نور فلورسنت منتشر می شود. هرچه میزان غلظت DNA در طی واکنش PCR بیشتر شود، میزان ثبت جذب فلورسنت به وسیله شناساگر دستگاه بیشتر خواهد بود. در انتهای هر سیکل شدت نور فلورسنت را اندازه گیری کرده و بر اساس آن یک منحنی رسم می کنند. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد به محاسبه غلظت DNA هدف در نمونه مورد مطالعه می پردازند.

به قول معلم ها حالا وقت جمع بندی است:

در تکنیک RT-PCR یک مولکول گزارشگر فلورسنت حضور دارد. وظیفه این مولکول فلورسنت مشاهده پیشرفت پی سی آر است. قدرت سیگنال فلورسنتی که تولید می شود، با مقدار مولکول هایی که تکثیر می گردند؛ رابطه مستقیم دارد. در این روش به مقایسه میزان محصولات تولید شده حین یک آزمایش PCR و میزان محصولات تولید شده حین آزمایش های PCR با مقدار نوکلئیک اسید شروع کننده مشخص، می پردازند. بدین ترتیب می توان به این موضوع پی برد که چه مقدار نوکلئیک اسید اولیه در نمونه وجود داشته است.

خُب تا بدین جا در قالب دو عبارت ساده تکنیک RT-PCR را برایتان شرح دادیم. مطمئنا با یکی از این دو تعریف بهتر از دیگری ارتباط برقرار کرده و سر نخ اصلی را گرفته اید. حالا بیایید برویم سراغ اصول تکنیک RT-PCR!

آشنایی با اصول تکنیک RT-PCR

بارها گفته ایم، لازم باشد باز هم می گوییم؛ تکنیک RT-PCR روشی قدرتمند است که در راستای اندازه گیری مقدار DNA مورد مطالعه به کار گرفته می شود. تکنیک مذکور توانمندی های خود را بر اساس اصولی که در ادامه به معرفی و بررسی مختصر آن ها می پردازیم، بیان می کند:

¯    Fluorescent Probe

در تکنیک RT-PCR از یک پروب فلورسنت که به DNA وصل می گردد، استفاده می کنند. هنگامی که DNA تکثیر می شود، پروب متصل شده به آن شروع به انتشار نور فلورسنت می کند.

¯    Monitoring Amplification

تکنیک RT-PCR زمینه ای را فراهم می سازد که محققان در طی انجام واکنش PCR، قادر به اندازه گیری مقدار فلورسانس DNA تکثیر شده باشند. با این اوصاف آن ها می توانند مقدار DNA را به صورت کاملا دقیق و در زمان واقعی بسنجند.

¯    Applications

تکنیک RT-PCR کاربرد گسترده ای در بیوتکنولوژی و علوم زیستی دارد. این تکنیک به عنوان یک ابزار بسیار قوی در جهت تشخیص موارد زیر مورد استفاده قرار می گیرد:

• ویروس ها
• میکروب ها
• مطالعه بیان ژن ها
• تحقیقات مولکولی
• …

مایلید به اتفاق این موارد را به صورت دقیق تر مورد بحث و بررسی قرار دهیم؟!

کاربردهای تکنیک RT-PCR

اگرچه کاربردهای تکنیک RT-PCR بسیار متعدد و متنوعند، اما ما در این مطلب به بیان چند مورد از آن ها بسنده می کنیم.

تشخیص و شناسایی ویروس ها و میکروب ها

اگر بگوییم تکنیک RT-PCR یکی از دقیق ترین و حساس ترین ابزارهای موجود برای تشخیص ویروس ها و میکروب ها در نمونه های بیولوژیکی است، گزاف نگفته ایم. این ابزار کاربردی مقدار ویروس ها و میکروب های موجود در نمونه را بسیار دقیق تر از آنچه که فکرش را می کنید، اندازه می گیرد!

مطالعه بیان ژنتیکی

یکی از اصلی ترین کاربردهای تکنیک RT-PCR، استفاده از آن در راستای بررسی و اندازه گیری میزان بیان ژن ها در سلول ها و بافت های مورد مطالعه است. با وجود این ابزار قدرتمند محققان می توانند به بررسی میزان بیان ژن ها در شرایط مختلف نظیر بیماری ها یا درمان های گوناگون بپردازند.

تحقیقات مولکولی

یکی از مهم ترین و اساسی ترین کاربردهای تکنیک RT-PCR استفاده از آن در تحقیقات مولکولی است. محققان از طریق این ابزار می توانند به بررسی تغییرات مولکولی در سلول ها و بافت ها پرداخته و مطالعات گسترده ای را در زمینه بیولوژی، ژنتیک و پزشکی آغاز نمایند.

تعیین ژنوتیپ و فنوتیپ

تکنیک RT-PCR را به وفور در راستای تعیین ژنوتیپ و فنوتیپ در مطالعات ژنتیکی و بیولوژیکی استفاده می کنند. این ابزار کارآمد زمینه ای را فراهم می سازد که محققان بتوانند ضمن تعیین تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی در نمونه های گوناگون، به مطالعه این موارد بپردازند.

اگر به خاطر داشته باشید، در ابتدای کار تکنیک PCR را خدمتتان معرفی کردیم و گفتیم که RT-PCR نمونه ای از PCR است. حال می خواهیم به طور دقیق تر به مقایسه این دو تکنیک کاربردی بپردازیم و با بیان تفاوت های آنان، تمایزشان را برایتان ساده تر کنیم. برای یادگیری یک مبحث کاربردی آماده اید؟!

مقایسه تکنیک PCR و RT-PCR

به عنوان اصلی ترین شباهت میان این دو تکنیک، باید بدانید که هر دوی آن ها جزء قدرتمندترین ابزارهای موجود برای افزایش تعداد کپی های یک قطعه DNA محسوب می شوند. با این حال تفاوت های میان آن ها بسیار بارز است. این را با نگاهی کلی به جدول زیر می توانید دریابید.

مزایا و معایب تکنیک RT-PCR

تکنیک RT-PCR دارای مزایای گوناگونی است که از جمله مهم ترین آن ها می توان به موارد زیر اشاره کرد:

• دقت بالا
• سرعت زیاد
• قابلیت اندازه گیری دقیق تعداد کپی ها
• امکان انجام تحقیقات ژنتیکی و بیولوژیکی پیچیده و دشوار
• …

معایب این روش نیز به قرار زیرند:

• هزینه قابل توجه
• نیاز به دانش و مهارت
• نیاز به تجهیزات فنی خاص

عجیب، اما واقعی…

شاید برایتان عجیب و غیر قابل باور به نظر برسد، اما حقیقت این است که تکنیک RT-PCR را در تشخیص و درمان بیماری های گوناگون بسیاری مورد استفاده قرار می دهند. بیماری های عفونی، بیماری های ژنتیکی، بیماری های عصبی، بیماری های قلبی و بیماری های سرطانی نمونه هایی از صدها بیماری ای هستند که نقش این تکنیک در تشخیص و درمان آن ها به سزا است!