استخراج پروتئین و وسترن بلات
هر آنچه لازم است درباره استخراج پروتئین و وسترن بلات بدانید!
استخراج پروتئین از بافت ها و سلول های کشت شده، نخستین گامی است که برای عملی کردن تعداد قابل توجهی از تکنیک های بیوشیمیایی و تحلیلی برداشته می شود. از جمله مهم ترین این تکنیک ها می توان به موارد زیر اشاره کرد:
- تصفیه پروتئین
- تصفیه وسترن بلات
- طیف سنجی جرمی
همان طور که در جریان هستید، پروتئین ها یکی از اصلی ترین اجزای سلول ها، بافت ها و ارگانیسم ها محسوب می شوند. ماکرومولکول های مذکور متشکل از رشته های طولانی اسید آمینه ای هستند که به صورت کاملا اختصاصی در پیکربندی های سه بعدی مستقر شده اند. همین ماکرومولکول هایی که درباره شان صحبت می کنیم، می توانند آغازگر هزاران مسیر بیوشیمیایی حاکم بر عملکرد یک ارگانیسم یا واسطه این مسیر باشند. اگر به مطالعه دقیق پروتئین ها بپردازید، اطلاعات به دردبخور بسیاری عایدتان می شود. اطلاعاتی در رابطه با عملکرد بدن انسان، مسیرهای بیماری و بیان کد ژنتیکی!
مطالعه پروتئین ها؛ مسیری لذت بخش، اما پرچالش!
اگر فکر می کنید مسیر مطالعه پروتئین ها هموار و خالی از چالش است، سخت در اشتباهید. بزرگ ترین و اساسی ترین چالشی که در این مسیر با آن رو به رو خواهید شد؛ انتخاب بهترین و مناسب ترین روش برای استخراج پروتئین است. برای آن که بتوانید مطلوب‌ترین روش ممکن برای استخراج پروتئین را برگزیده و استارت این مطالعه شیرین را بزنید؛ می‌بایست سوال های زیر را از خودتان بپرسید جواب بدهید.
- قصد جداسازی پروتئین از چه بافتی را دارید؟
- می خواهید به مطالعه کدام پروتئین ها بپردازید؛ پروتئین های سیتوزولی، خارج سلولی یا ترشحی؟
- آیا حفظ تعامل پروتئین با پروتئین بومی و ساختار سوم در طی فرآیند استخراج پروتئین برایتان حائز اهمیت است؟
- آیا می دانید که قصد استخراج کدام پروتئین خاص را دارید یا این که می خواهید به جداسازی یک نمونه گسترده روی بیاورید؟
پس از این که به سوالات فوق الذکر پاسخ درست و حسابی دادید و نمونه مورد نظر را تعیین کردید؛ می توانید با در نظر گرفتن اهداف آزمایش به انتخاب مناسب ترین روش استخراج پروتئین بپردازید. مایلید در ادامه مهم ترین مراحل استخراج پروتئین را به اتفاق مورد بحث و بررسی قرار دهیم؟!
اگر پاسختان مثبت است، تیترهای بعدی را برای شما نگاشته ایم!
مراحل اولیه استخراج
استارت استخراج پروتئین را با یک خرابکاری، ببخشید با یک تخریب مکانیکی نظیر ایجاد یک برش یا خرد کردن بافت برای تبدیل به قطعات ریزتر می زنیم. اگر هدف ما استخراج پروتئین های داخل سلولی باشد، با استفاده از مواد شوینده به جداسازی غشای سلولی فسفولیپید می پردازیم. امواج فراصوت بهترین پیشنهاد برای ایجاد تخریب در غشاء هستند. برای این که تخریب آنزیمی موجب از بین رفتن پروتئین ها نشود، مهار کننده پروتئاز را به مخلوط مورد نظر می افزایند.
سانتریفیوژ
مرحله سانتریفیوژ مرحله جداسازی قطعات بزرگ بافت پس از تخریب در بافت اولیه خام می باشد. شاید برایتان جالب باشد بدانید که سانتریفیوژ دیفرانسیل نقش حائز اهمیت و غیر قابل انکاری در استخراج پروتئین ایفا می کند. سرعت و زمان سانتریفیوژ اندامک های داخل سلولی را به صورت انتخابی وارد گلوله می کنند. بدین ترتیب پروتئین ها از طریق دورهای متنوع سانتریفیوژ از محفظه سلول استخراج می گردند.
استخراج پروتئین از طریق بر هم کنش های شیمیایی
زنجیره های جانبی اسید آمینه را به طور عمده در راستای کمک به استخراج پروتئین مورد استفاده قرار می دهند. به عنوان یک مثال ساده می توان به یک ستون تبادل یونی یا یک ستون آبگریز اشاره کرد. اسیدهای آمینه با زنجیره جانبی دارای بار مثبت عبارتند از:
- آرژنین
- هیستیدین
- لیزین
این در حالی است که اسیدهای آمینه با زنجیره جانبی دارای بار منفی به قرار زیرند:
- اسید آسپارتیک
- اسید گلوتامیک
- سایر اسیدها
اسیدهای آمینه با زنجیره جانبی آبگریز نیز شامل اسیدهایی هستند که در ادامه نامشان را ذکر می کنیم:
- تیروزین
- تریپتوفان
- فنیل آلانین
- والین
- ایزولوسین
- …
این وابستگی ها زمینه ای را فراهم می سازند که پروتئین ها جذب ستونی متشکل از یک ماتریس مثبت، یک ماتریس منفی یا یک ماتریس آبگریز گردند. پس از جذب پروتئین ها به یکی از ستون های مذکور، می توان آن ها را به عنوان نمونه غنی شده شست و بدین ترتیب از بین برد.
استخراج از طریق ستون سازی
به عنوان یکی از موثرترین روش های استخراج پروتئین می توان به استخراج از طریق ستون سازی و ستون های میل ترکیبی اشاره کرد. این روش به صورت عمده برای جداسازی پروتئین های عمومی مورد استفاده قرار می گیرد.
در صورتی که هدف آزمایشی ای که برای تحقق آن تلاش می کنید، نیازمند استخراج یک پروتئین خاص است؛ بهتر است روش های مناسب تری را برای انجام کار برگزینید. این امر علی الخصوص برای آنتی بادی ها و آنتی ژن ها که وابستگی قابل توجهی به هم دارند، مفید می باشد.
پروتئین های استخراج شده چه کاربردی دارند؟
از آن جا که پروتئین ها یکی از مولکول هایِ مهمِ مورد مطالعه در تحقیقات بیولوژیکی هستند، استخراج آن ها بسیار حائز اهمیت و کاربرد آن ها بسیار گسترده است. استفاده از پروتئین های استخراجی از تولید محصولات تجاری گرفته تا انجام تحقیقات پیچیده آزمایشگاهی رواج دارد. یکی از اساسی ترین کاربردهای پروتئین های استخراج شده، کاربردهای بالینی است. شاید برایتان جالب باشد بدانید که این پروتئین های را به وفور در راستای تشخیص بیماری ها و درمان آن‌ها مورد استفاده قرار می دهند. وقتی فردی برای انجام آزمایشات پزشکی راهی آزمایشگاه می‌شود و از وجود انسولین در ادرار خود آگاه می‌گردد؛ می‌تواند آن را شاخصی برای ابتلا به دیابت در نظر بگیرد.
سایر کاربردهای پروتئین های استخراج شده عبارتند از:
- پروتئین شناسی
- کاربردهای تحقیقاتی
- سنجش آنزیم
- …
اکنون که با استخراج پروتئین، روش های انجام و کاربردهای آن آشنا شدیم؛ وقت آن فرا رسیده که بحث درباره وسترن بلات بپردازیم. اگر برای یادگیری یک مطلب جدید آماده اید؛ ادامه مطلب را به هیچ قیمتی از دست ندهید!
آشنایی با وسترن بلات
وسترن بلات که از آن تحت عناوین دیگری همچون پروتئین بلاتینگ یا ایمونو بلاتینگ نیز یاد می کنند، یکی از مهم ترین و قدرتمندترین روش های شناسایی پروتئین ها است. استفاده از این روش علی الخصوص در تحقیقات پزشکی با هدف جداسازی و شناسایی پروتئین ها بسیار مرسوم می باشد. محققان با به کارگیری روش وسترن بلات با آنتی بادی اختصاصی به شناسایی اختصاصی پروتئین هدف می پردازند.
استفاده از وسترن بلات به سال 1970 میلادی باز می گردد. در آن زمان توبین و همکارانش با استفاده از ژل پلی آکریل آمید به جداسازی پروتئین ها و انتقال آن‌ها به غشای نیتروسلولز روی آوردند. بعد از آن شخصی به نام بارنت به جداسازی پروتئین ها با استفاده از این ژل پرداخت و بدین ترتیب؛ زمینه را برای پیدایش وسترن بلات فراهم ساخت.
جالب و در عین حال لازم است بدانید که وسترن بلات، تکامل یافته تکنیک ساترن بلات می باشد. محض یادآوری خدمتتان عرض می کنیم که ساترن بلات؛ تکنیکی کارآمد و پر بازده برای تشخیص و شناسایی قطعات DNA جدا شده توسط ژل الکتروفوز می باشد.
در دنیای امروز وسترن بلات را به عنوان یک ابزار دقیق در راستای شناسایی پروتئین ها در بزرگترین تحقیقات و طرح های پژوهشی روز دنیا، مورد استفاده قرار می دهند. این مسئله موجب استقبال بی نظیر و چشمگیر دانشجویان علوم پزشکی و سایر محققان بیولوژی از یادگیری این تکنیک پرکاربرد شده است.
دلایل استفاده از تکنیک وسترن بلات
تا بدین جا دریافتیم که وسترن بلات یکی از کاربردی ترین تکنیک‌های به کار گرفته شده در مسیر تحقیق، توسعه و تولید داروهای پزشکی و تشخیص و درمان بیماری‌ها است. این تکنیک که مورد توجه ویژه پژوهشگران علوم آزمایشگاهی و بیولوژیست‌ها قرار گرفته؛ نتایج کیفی قابل قبولی را در جهت تعیین محتوای پروتئین هدف در نمونه های مختلف ارائه می‌دهد. محققان نتایج کیفی به دست آمده از این روش را به نتایج کمی تبدیل نموده و از این طریق به تشخیص بیان پروتئین می پردازند.
