آشنایی با طراحی و سنتز پرایمر و اهمیت چشمگیر آن ها در واکنش های زنجیره ای پلیمراز

اگر جزء علاقه مندان به طراحی و سنتز پرایمر هستید، تبریک می گوییم؛ جای خوبی آمده اید. ما در این مطلب قصد داریم شما را خیلی ساده و صریح با مفهوم پرایمر آشنا کنیم، از واکنش های PVR و نقش پرایمر در آن ها برایتان سخن بگوییم، سپس برویم سراغ بحث طراحی و سنتز پرایمر و هر آنچه لازم است در این باره بدانید. اگر این مقاله درست همان چیزی است که مدت هاست دنبالش می گردید، تیترهای ناب آن را به هیچ قیمتی از دست ندهید. بزنید برویم سراغ اصل مطلب تا دیر نشده است!

پرایمر چیست؟

به مولکول کوچک تک رشته ای که از جنس DNA بوده و در واکنش های زنجیره ای پلیمراز شرکت می کند، پرایمر یا توالی آغازگر گفته می شود. پرایمرها قطعات الیگو نوکلئوتیدی بوده و حضور آن ها در واکنش های PCR برای تکثیر قطعه نام برده الزامی می باشد. جالب است بدانید که این رشته نقطه شروع سنتز DNA محسوب می گردد. اگر جویای اندازه پرایمرها هستید، باید خدمتتان عرض کنیم که ابعاد این مولکول ها بین 18 تا 24 نوکلئوتید متغیر است.

شاید این سوال ذهنتان را به خود درگیر کرده باشد که واکنش زنجیره ای پلیمراز یا به اختصار PCR چیست؟ از کنار درگیری ذهنتان بی تفاوت عبور نخواهیم کرد!

آشنایی مختصر و مفید با واکنش های زنجیره ای پلیمراز (PCR)

سال 1983 بود که سروکله واکنش زنجیره ای پلیمراز ملقب به PCR برای نخستین بار در حوزه بیو پیدا شد. این تکنیکِ ناشناخته آن روزها، به یکی از متداول ترین و ضروری ترین روش ها برای استفاده در آزمایش های مولکولی بالینی و پژوهشی امروزی تبدیل شده است. اگر بگوییم این روش؛ علوم پزشکی و تشخیص و درمان بیماری ها، میکروبیولوژی، علوم جنایی و تعیین هویت ژنتیکی را با تحولات بزرگی رو به رو نموده، گزاف نگفته ایم.

در حقیقت PCR روش تکثیر ماده ژنتیکی در مقادیر بسیار زیاد می باشد. لازم به ذکر است که این روش بر مبنای چرخه های حرارتی تکرار شونده عمل می کند. در گام نخست دو رشته DNA در اثر حرارت زیاد از هم گسسته شده و به صورت تک رشته ای در می آیند. اگر خاطرتان باشد، پیش تر گفتیم که مولکول های تک رشته ای از جنس DNA را پرایمر می نامند. در مرحله بعد دما تا حد قابل توجهی کاهش پیدا کرده و پرایمرهای به دست آمده از مرحله پیش به توالی های هدف وصل می گردند. به منظور شناسایی، اتصال و تکثیر قطعه هدف وجود دو پرایمر الزامی می باشد. می دانید این پرایمرها از کجا می آیند؟!

آن ها پس از طراحی پرایمر، سنتز می شوند. یکی از این مولکول ها به توالی هدف و آن یکی به رشته مکمل آن اتصال پیدا می کند. پرایمر نخست را پرایمر پیشرو و پرایمر دوم را پرایمر معکوس می نامند. پس از این که اتصالات نام برده برقرار شدند، فرآیند تکثیر قطعه هدف در حضور آنزیم DNA پلیمراز استارت می خورد.

نقش پرایمر در واکنش های PCR

پرایمرها یا اصطلاحا توالی های آغازگر؛ از جمله مهم ترین توالی هایی هستند که حضور آن ها برای شروع فرآیند تکثیر در واکنش PCR الزامی می باشد. این توالی ها از دو عملکرد ویژه برخوردارند. در ادامه هر یک از این عملکردها را به طور مختصر، اما مفید مورد بحث و بررسی قرار می دهیم.

شناسایی توالی هدف و اتصال به جایگاه مورد نظر

نخستین عملکردی که پرایمرها از خود به نمایش می گذارند، شناسایی توالی هدف و اتصال به جایگاه مورد نظر می باشد. لازم به ذکر است که امکان رخداد این موضوع تنها در صورت طراحی و سنتز پرایمر به شکل اختصاصی میسر می باشد. این مسئله مهم را مد نظر داشته باشید که کیفیت پرایمرهای طراحی شده تاثیر به سزایی در دقت و صحت نتایج آزمایش PCR دارد.

تعیین طول قطعات مورد نظر برای تکثیر

تعیین طول قطعات مورد نظر برای تکثیر یکی دیگر از عملکردهای مهم پرایمرها است. برای تعیین طول قطعه هدف، حد فاصل میان دو پرایمر را اندازه گیری می کنند. گفتنی است که اندازه این قطعه در هنگام طراحی و سنتز پرایمر تعیین شده و فرآیند طراحی بر اساس آن صورت می پذیرد.

نحوه انجام طراحی و سنتز پرایمر

پر واضح است که طراحی و سنتز پرایمر به کمک نرم افزارهای بیوانفورماتیکی خاص قابل انجام می باشد. با وجود این نرم افزارهای کاربردی می توان به بررسی تخصصی پارامترهایی همچون طول پرایمر، طول قطعه هدف، دمای ذوب، محتوای GC و… پرداخت. در ادامه هر یک از این پارامترها را معرفی و ویژگی های آن ها را به اختصار مورد بحث قرار می دهیم.

طول پرایمر

طول پرایمرها به صورت بهینه بین 18 تا 24 جفت باز می باشد. در صورتی که طول پرایمری بیش از 24 جفت باز باشد، در مرحله اتصال به توالی هدف با مشکل رو به رو می گردد. این مسئله مانع از تکثیر درست قطعات هدف شده و واکنش PCR را با مشکل مواجه می کند. شاید بگویید یعنی اگر طول پرایمرها کمتر از حد استاندارد باشد؛ ایرادی ندارد؟!

بله که ایراد دارد. در صورتی که اندازه پلیمرها کمتر از حد استاندارد باشد؛ اتصال در نواحی غیر اختصاصی رخ داده و این موضوع موجب پیدایش محصولات غیر اختصاصی PCR می گردد.

طول قطعه هدف

طول محصول PCR یا اصطلاحا طول قطعه هدف با در نظر گرفتن نوع واکنش پی سی آر و اندازه توالی هدف بین 200 تا 1000 جفت باز متغیر می باشد. برای آن که توالی های طویل تری تکثیر شوند، وجود آنزیم ها و شرایط خاص واکنش الزامی می باشد. علاوه بر این ها لازم است که در زمان طراحی و سنتز پرایمر، شرایط ژن هدف را برای خوانش بهینه در نظر بگیرید. چرا که پرایمر یکی از اصلی ترین و ضروری ترین اجزای فرآیندهای توالی یابی محسوب می شود.

دمای ذوب پرایمر

به دمایی که باعث جداسازی نیمی از پرایمرها از DNA الگو می شود، دمای ذوب پرایمر می گویند. این دما بین 50 الی 60 درجه سانتی گراد متغیر می باشد. نکته حائز اهمیت در حین طراحی و سنتز پرایمر این است که اختلاف دمای پرایمر پیشرو و معکوس بیش از 3 درجه سانتی گراد نباشد. لازم به ذکر است که دمای ذوب پرایمرها به طور کاملا اتوماتیک توسط نرم افزارهای طراحی پرایمر محاسبه می شود.

دمای اتصال پرایمر

منظور از دمای اتصال دمایی است که پرایمرها در آن به DNA الگو وصل می شوند. توجه به این دما در هنگام طراحی و سنتز پرایمر بسیار حائز اهمیت است.

محتوای GC

هرچه محتوای GC بالاتر باشد، اتصال ایجاد شده میان پرایمرها و DNA الگو پایدارتر خواهد بود. در صورتی که محتوای GC یک پرایمر بین 40 الی 60 درصد باشد؛ می توان نتیجه گرفت که آن پرایمر دارای GC بهینه می باشد.

توالی های تکراری یا مکمل

در صورتی که چهار یا چند باز منفرد همچون ACCCCC یا تکرارهای دی نوکلئوتیدی همچون ATATATATAT در طراحی و سنتز پرایمر حضور داشته باشند، واکنش PCR دچار مشکل خواهد شد. برای پیشگیری از بروز این اختلال، پرایمرهای طراحی شده را در پایگاه های اطلاعاتی قرار داده و بدین ترتیب از اختصاصی بودن آن ها اطمینان حاصل می نمایند. در صورتی که پرایمرها غیر اختصاصی باشند، ممکن است به توالی های مشابه وصل شده و به تکثیر نواحی دیگر بپردازند.

ساختارهای ثانویه

ساختارهای ثانویه در پرایمرها از واکنش های میان مولکولی و درون مولکولی ناشی می شوند. این ساختارها می توانند موجبات بروز اختلال در عملکرد یک یا هر دوی پرایمرها را فراهم ساخته و بدین ترتیب بر کیفیت محصول PCR اثر بگذارند. این ساختارها در انواع متعدد و متنوعی موجودند که مهم ترین آن ها عبارتند از:

• ساختار سنجاق سر
• پرایمر دایمر

در صورتی که می خواهید طراحی و سنتز پرایمر را با موفقیت به پایان برسانید، باید حین طراحی به کلیه نکات فوق الذکر توجه نمایید. این نکته را نیز مد نظر قرار دهید:

طراحی و سنتز پرایمر باید به گونه ای صورت بپذیرد که پرایمر به دست آمده مکمل توالی هدف باشد. علاوه بر این، پرایمر مذکور به غیر از منطقه هدف به هیچ بخش دیگری از DNA الگو وصل نشود. به همین راحتی!