سنتز cDNA و هرآنچه لازم است درباره آن بدانید!
سنتز cDNA یکی از داغ ترین مباحثی است که به وفور در حوزه بیو و مهندسی ژنتیک مطرح می گردد. اگر از اهالی این حوزه باشید، به احتمال قریب به یقین با cDNA و نحوه سنتز آن آشنا هستید. شاید هم تازه واردید و از همین رو آشنایی چندانی با مفاهیم و اصطلاحات پیچیده و قلمبه سلمبه زیست شناسی ندارید. اگر چنین است، باید خدمتتان عرض کنیم که cDNA همان دی ان ای مکملی است که بارها و بارها نامش را شنیده اید. نشنیده اید؟!
مثل این که مشکل عدم آشنایی شما با cDNA خیلی جدی تر از این حرف هاست و باید به صورت ریشه ای حل شود. موافقید به اتفاق cDNA را موشکافی کرده و جیک و پوکش را روی داریه بریزیم؟!
cDNA چیست؟
هرچه زمان می گذرد و جلوتر می رویم؛ شاهد توسعه روزافزون فناوری های زیستی بیشتری هستیم. این موضوع نیاز به فراگیری تکنیک های مرتبط با این حوزه را به الزامی غیر قابل انکار تبدیل نموده است. در عصر حاضر که با یک سرچ ساده می توان سیر تا پیاز یک موضوع را سه سوته درآورد، عدم شناخت مفاهیم اساسی ای همچون DNA و cDNA می تواند یک فاجعه علمی باشد!
همان طور که در جریان هستید، ژن ها از دو ناحیه اساسی تحت عنوان نواحی اگزونی و اینترونی ساخته شده اند. محققان برای آن که بتوانند نواحی اگزونی و کد کننده یک ژن را بررسی کنند؛ چاره ای جز حذف نواحی اینترونی و نواحی غیر کد کننده آن ندارند. دی ان ای مکمل یا به اصطلاح cDNA به رشته ای از مولکول های DNA اطلاق می گردد که تحت فعالیت آنزیم رونوشت بردار معکوس از روی رشته mRNA ای که بالغ است، سنتز می شود. در واقع رشته های cDNA رونوشت رشته های DNA از روی رشته mRNA فاقد نواحی اینترونی هستند.
سنتز cDNA
اهالی حوزه بیو بهتر از هر کسی می دانند که مکانیسم های متعدد و متنوع بسیاری برای سنتز cDNA ها یا اصطلاحا دی ان ای های مکمل وجود دارد. با این حال سنتز این مولکول ها از رویmRNA بالغ که از طریق بهره گیری از آنزیم رونوشت بردار معکوس انجام می شود؛ مرسوم ترین روش پیش رو برای تهیه آن ها است. آنزیم مذکور که یکی از سرشناس ترین و در عین حال کارآمدترین آنزیم های حوزه زیست محسوب می گردد، در امتداد رشته mRNA بالغ به حرکت در می آید. این حرکت از طریق ایجاد یک پیوند هیدروژنی، موجبات قرارگیری دئوکسی ریبونوکلئوتید مکمل هر یک از ریبونوکلئوتیدهای mRNA در مقابل یکدیگر را فراهم می سازد. بدین ترتیب ضمن تشکیل یک رشته هیبرید، عمل سنتز cDNA انجام می شود.
کاربرد سنتز cDNA
جالب و در عین حال لازم است بدانید که سنتز cDNA دارای کاربردهای گسترده ای است که از جمله مهم ترین آن ها می توان به موارد زیر اشاره کرد:
بررسی بیان ژن ها
شاید برایتان جالب باشد بدانید که بررسی بیان ژن ها یکی از اساسی ترین کاربردهای سنتز دی ان ای مکمل محسوب می شود. امکان اندازه گیری مقدار و نوع mRNA های ساخته شده توسط ژن هدف از این طریق در شرایط گوناگون سلولی، بافتی و فیزیولوژیکی میسر می باشد. بدین منظور از روش RT-QPCR که در طی آن مقدار cDNA موجود در هر دوره PCR را با به کارگیری نشانگرهای فلورسانس می سنجند، استفاده می کنند.
ساخت کتابخانه های cDNA
از طریق سنتز cDNA می توان همه mRNA یک بافت یا سلول را به مولکول دی ان ای مکمل تبدیل کرده و آن ها را در پلاسمیدهای گوناگون تعبیه نمود. با این کار مجموعه ای از دی ان ای های مکمل مربوط به ژن های فعال در یک بافت یا سلول ایجاد می گردد. امکان استفاده از این مجموعه کاربردی به منظور بررسی تکامل، تنوع ژنتیکی، تفاوت بافتی و… امکان پذیر می باشد.
کلونینگ ژن ها
مولکول های DNA مکمل عمدتا در راستای کلونینگ ژن های یوکارتی در سلول های پروکاریوتی نیز مورد استفاده قرار می گیرند. سلول های پروکاریوتی دسته ای از پرکاربردترین سلول های ساده پیش هسته ای هستند. علاوه بر این، cDNA ها بعد از سنتز در تروویروس ها که به عنوان نمونه ای از آن ها می توان به ویروس نقص ایمنی اکتسابی ایدز اشاره کرد؛ به ژنوم میزبان متصل شده و از این طریق پروویروس ها را به وجود می آورند.
سایر کاربردهای سنتز دی ان ای مکمل به قرار زیرند:
- مهندسی ژنتیک
- تهیه پروب
- توالی یابی
- …
آشنایی با پرایمرهای استفاده شده در سنتز cDNA
تا بدین جا دریافتیم که اولین گام برای مطالعه مقدار بیان ژن ها، استخراج RNAها از سلول می باشد. در گام بعدی از طریق آنزیم رونوشت بردار معکوس که کاربلدهای این حوزه از آن با نام لاکچری Reverse Transcriptase یاد می کنند؛ به ساخت مولکول cDNA می پردازند. مولکول های سی دی ان ای که آن ها را تحت عنوان مولکول دی ان ای مکمل نیز می شناسند، رشته ای از مولکول های DNA به دست آمده از روی mRNA های بالغ هستند. پس از سنتز این مولکول ها، می توان از طریق روش Real-Time PCR به آنالیز کمی از مقدار بیان ژن مورد نظر پرداخت. در سنتز cDNA نیز درست مانند سنتز سایر مولکول ها از پرایمرهای مختلفی استفاده می شود. در ادامه هر یک از این پرایمرها را معرفی نموده و به اختصار مورد بررسی قرار می دهیم.
پرایمر Oligo-dt
هدف از به کارگیری این پرایمر تولید cDNA از روی mRNA است. از آن جا که پرایمر مذکور غنی از نوکلئوتید تیمین است، با انتهای رشته mRNA مکمل بوده و به بخش پایانی آن می چسبد.
رندوم هگزامر
پرایمرهای رندوم هگزامر از دیگر پرایمرهایی هستند که در راستای سنتز cDNA از دیگر RNA های استخراج شده مورد استفاده قرار می گیرند. جالب است بدانید که اتصال این پرایمرها به بخش های مختلف RNA به شکل کاملا تصادفی صورت می پذیرد.
پرایمرهای تخصصی
استفاده از پرایمرهای تخصصی مختص زمانی است که قصد استفاده از RNA هایی نظیر Micro RNA را داریم. پرایمر Stem-loop یکی مهم ترین پرایمرهای اختصاصی است که یک ساختار سنجاق سری با Hairpin ایجاد نموده و بدین ترتیب امکان اتصال و شناسایی اختصاصی این RNA ها را ممکن می سازد.
مراحل سنتز cDNA
برای درک بهتر مراحل سنتز cDNA نخست شکل زیر را به صورت اجمالی مورد بررسی قرار داده و سپس سراغ ادامه مطلب بروید.
در سنتز cDNA نخست نمونه هایی را که حاوی RNA هستند، به داخل تیوب منتقل می نمایند. توجه داشته باشید حلال آبی ای که RNA در آن حل می شود، می بایست فاقد RNA ase باشد. در گام بعدی پرایمرها را به تیوب اضافه می کنند. سپس نمونه ها را به مدت 5 دقیقه در دستگاه سیکل حرارتی دارای دمای 65 درجه سانتی گراد می گذارند. در این حین رشته های RNA شروع به باز شدن از یکدیگر می کنند. در مرحله بعد نمونه ها را بر روی یخ قرار داده و به هر تیوب مقدار مشخصی مسترمیکس می افزایند. سپس مجددا آن ها را به دستگاه سیکل حرارتی منتقل می کنند.
در سیکل نخست که در دمای 55 درجه سانتی گراد اتفاق می افتد، پرایمرها و پس از آن آنزیم ها وصل شده و فرآیند سنتز صورت می پذیرد. اکنون نوبت سیکل دوم است که در دمای 85 درجه سانتی گراد رخ می دهد. این سیکل مربوط به غیر فعال سازی آنزیم ها می باشد. پس از آن نوبت سیکل سوم و سرد شدن نمونه ها است. بعد از اتمام این سیکل، نمونه ها را به منظور نگهداری صحیح به دمای منفی بیست درجه سانتی گراد منتقل می نمایند.
خب این جا پایان مطلب است و انتظار می رود که اکنون سیر تا پیاز سنتز cDNA را از بَر باشید. اگر احساس می کنید هنوز به این بحث تسلط کافی ندارید، یکی دو بار دیگر مقاله را به دقت بخوانید. شک نداریم که با هر بار خواندن نکات طلایی جدیدی کشف می کنید که حسابی به دردتان می خورد!
