رنگ آمیزی سلول ها به روش DAPI/PI
اگر کم و بیش اهل حوزه بیو و آزمایشگاه زیست‌شناسی بوده و از رنگ آمیزی سلول‌ها سر در بیاورید، بی شک آوازه روش‌های رنگ آمیزی DAPI/PI به گوشتان رسیده است. شاید هم از این مبحث حیاتی چیزی نمی‌دانید و با خواندن همین تک جمله ابتدایی می‌خواهید بپرسید مگر سلول ها را رنگ آمیزی می کنند؟ یعنی هدف از این کار چه می تواند باشد؟!
ما فرض را بر این گذاشته‌ایم که همه خوانندگان مقاله حاضر جزء گروه دوم هستند و به دنبال یک مطلب اساسی برای رفع ابهام می‌گردند. پس بر آن شده ایم که صفر تا صد موضوع رنگ آمیزی سلول ها را موشکافی کرده و شما را با دو متد کاربردی موجود در این زمینه، آشنا کنیم. اگر برای یادگیری این مبحث مهم آماده اید، بزنید برویم سراغ اصل مطلب تا بیش از این دیر نشده است!
رنگ آمیزی سلول ها
نمی دانیم تا به حال به بررسی میکروسکوپی یک سلول پرداخته اید یا نه. منظورمان این است که یک سلول را زیر میکروسکوپ نوری قرار داده و سیر تا پیازش را روی داریه بریزید. اگر این کار را کرده باشید، حتما می دانید که سلول ها ساختاری بی رنگ دارند. نه قرمزند، نه آبی، نه سبز و نه حتی هیچ رنگ دیگر؛ بی رنگِ بی رنگند. این موضوع موجب شده که تفکیک آن‌ها از یکدیگر پیچیده، دشوار و گاها غیرممکن بوده و کار مطالعه یاخته‌ها، اندامک‌ها و ساختارهای گوناگون را با چالش رو به رو سازد. این جاست که پای رنگ آمیزی سلول ها به ماجرا باز می شود.
اگر بخواهیم خیلی ساده و صریح و به دور از اصطلاحات علمی و کلمات قلمبه سلمبه خدمتتان عرض کنیم؛ چنین می گوییم:
رنگ آمیزی سلولی روشی است که در طی آن کل سلول، بخشی از آن و یا یکی از اندامک‌ها را با هدف مشاهده بهتر در زیر میکروسکوپ رنگ آمیزی می‌نمایند. جالب است بدانید که برخی رنگ ها تنها مختص سلول های مُرده و برخی دیگر فقط مختص سلول های زنده هستند. این در حالی است که بعضی از آن ها را برای هر دوی این کاربردها مورد استفاده قرار می دهند. خلاصه این که دنیای رنگ آمیزی سلول ها پر از رنگ هایی است که هر یک با هدفی خاص مورد استفاده قرار می گیرند. از دیگر اهداف این نوع رنگ آمیزی می توان به موارد زیر اشاره کرد:
- بررسی مسیرهای متابولیکی
- تعیین توده زیستی یک اکوسیستم
حال ممکن است این سوال ذهنتان را به خود درگیر کرده باشد که چگونه می توان یک سلول را رنگ آمیزی کرد؟!
مسلما این کار با آبرنگ و مداد رنگی انجام نمی شود و فرآیند پیچیده تری دارد. فرآیندی چهار مرحله ای که در ادامه به بررسی مختصر آن می پردازیم.
روش رنگ آمیزی سلولی
نخست باید بدانید که روش‌های متعدد و متنوع بسیاری برای رنگ آمیزی سلول ها وجود دارد که انتخاب و اجرای آن ها، در گرو نوع و آنالیز رنگ آمیزی است. رنگ آمیزی DAPI/PI از جمله شناخته شده ترین روش های موجود در این زمینه هستند که در ادامه مطلب، آن ها را به صورت کلی مورد بحث قرار می دهیم. اکنون بیایید به اتفاق روش انجام این نوع رنگ آمیزی را بیاموزیم.
مرحله اول: نفوذپذیری
در این مرحله همان طور که از نامش پیداست، رنگ مورد نظر را به داخل سلول وارد می نمایند. برای این کار غشای سلول را با استفاده از یک سورفاکتانت ضعیف از بین برده و بدین ترتیب؛ شرایط را برای ورود مولکول‌های بزرگ رنگ به آن میسر می سازند.
مرحله دوم: تثبیت
در این مرحله از یک ماده شیمیایی تثبیت کننده نظیر فرمالدهید، متانول، اتانول یا پیکریک اسید استفاده می شود. این مواد به مولکول های پروتئینی پیوند خورده و از این طریق بر میزان انعطاف پذیری آن ها می افزایند.
مرحله سوم: اتصال
در گام سوم اتصال نمونه مورد نظر به لام انجام می شود. برای اتصال نمونه به لام دو را پیش رو دارید:
- سلول را به طور مستقیم بر روی لام کشت دهید.
- از روش استرلیزاسیون برای اتصال نمونه به لام استفاده کنید.
مرحله چهارم: رنگ آمیزی سلول
در این مرحله با در نظر گرفتن نوع نمونه و آنالیز مورد نظر، یکی از متدهای رنگ آمیزی را انتخاب نموده و تیر خلاص را بزنید. نوع متد انتخابی به زنده یا مرده بودن نمونه و حیاتی یا غیر حیاتی بودن رنگ آمیزی بستگی دارد. تعداد رنگ های مصرفی نیز با توجه به ساده یا مضاعف بودن رنگ آمیزی تعیین می شود. در روش ساده از یک رنگ برای کل سلول و در روش مضاعف از دو رنگ برای بخش های گوناگون سلول استفاده می کنند.
آشنایی با متداول ترین متدهای رنگ آمیزی سلول
تعداد متدهای گسترش یافته ای که از طریق آن ها می توان به رنگ آمیزی سلول ها پرداخت و بدین ترتیب مطالعه آن ها را ساده‌تر ساخت؛ بسیار زیاد است. متداول ترین روش های موجود در این زمینه عبارتند از:
- رنگ آمیزی DAPI/PI
- رنگ آمیزی بیسمارک برون
- رنگ آمیزی کارمین
- رنگ آمیزی هماتوکسیلین
- رنگ آمیزی هوچست
- رنگ آمیزی تولوئن زد
- رنگ آمیزی رودامین
- رنگ آمیزی متیلن بلو
- …
از هرچه بگذریم، سخن رنگ آمیزی DAPI/PI خوش تر است!
هر آنچه لازم است درباره رنگ آمیزی DAPI/PI بدانید!
جالب و در عین حال لازم است بدانید که محققان علاقه وافری به تعیین کمیت تعداد کل سلول ها و مشخص نمودن کمیت های مهم دیگری همچون تعداد سلول های زنده در مقابل سلول های غیر زنده دارند. آن ها از این طریق زیست توده باکتریایی را مشخص کرده و اطلاعات به دردبخور بسیاری به دست می آورند. تعداد تکنیک هایی که زحمت شمارش سلول ها و بررسی زنده مانی یا اصطلاحا ویابیلیتی آن ها را می کشند، به طور قابل توجهی زیاد است. رنگ آمیزی DAPI/PI از جمله کاربردی ترین و پر بازده ترین روش های موجود در این زمینه محسوب می شوند.
روش DAPI که به وفور در زمینه شمارش باکتری ها و سلول ها به کار گرفته می شود، با استفاده از رنگی تحت عنوان DAPI اجرا می شود. نام این نوع رنگ را از عبارت Diamond-2-phenylindole-6 برگرفته اند. این رنگ که نوعی رنگ DNA غیر قابل نفوذ به شمار می آید، تا حد قابل توجهی به وسیله غشای پلاسمایی سلول هایی که زنده هستند، حذف می گردد. این در حالی است که اگر همین رنگ به غشای سلول های آسیب دیده راه پیدا کند، با DNA آن ها به تعامل می پردازد.
اگر جویای تناسب استفاده از روش DAPI در زمینه شمارش سلول های زنده و غیر زنده هستید، باید خدمتتان عرض کنیم از آن جا که هیچ تمایزی میان سلول های زنده و غیر زنده قائل نمی شود، در این زمینه کاربرد چندانی ندارد. اگر با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت سلول های رنگ آمیزی شده با استفاده از رنگ DAPI را مورد بررسی قرار دهید، متوجه می شوید که رنگ آن ها آبی است. این رنگ کلیه سلول ها را بدون توجه به زنده بودن، زنده نبودن، گونه ها یا موجودات خاص رنگ آمیزی می کند.
همه چیز درباره رنگ آمیزی PI
رنگ آمیزی به روش PI که از آن با نام رنگ آمیزی پروپیدیوم یدید یاد می کنند، یکی دیگر از مرسوم ترین روش های رنگ آمیزی سلول ها است. این عامل فلوئورسنت که علاوه بر سلول ها برای رنگ آمیزی اسیدهای نوکلئیک مورد استفاده قرار می گیرد، توسط اتصال موجود در بین بازهای نوکلئیک اسید به مولکول های دو رشته ای دی ان ای وصل می شود. استفاده از این روش رنگ آمیزی که امروزه طرفداران بسیاری دارد؛ در زمینه های زیر رواج دارد:
- ارزیابی زنده ماندن سلول
- ارزیابی محتوای دی ان ای در تجزیه و تحلیل چرخه سلولی
- در تکنیک های میکروسکوپی برای مشاهده هسته و دیگر اندامک های حاوی دی ان ای
لازم به ذکر است که رنگ استفاده شده در روش رنگ آمیزی PI نمی تواند به غشا نفوذ پیدا کند. این ویژگی منحصر به فرد پروپیدیوم یدید را به گزینه ای ایده آل برای ایجاد تمایز میان سلول های سالم، سلول های نکروزی و سلول های آپوپتوزی تبدیل نموده است.
