درباره Live/Dead staining چه می دانید؟!

آنان که کم و بیش از زبان انگلیسی سر در می آورند و اصطلاحات این زبان را دست و پا شکسته معنا می کنند، می دانند که Live/Dead Staining درباره نوعی رنگ آمیزی برای تمایز میان زنده ها و مرده ها صحبت می کند. اما زنده و مرده چه چیزی؟!

نمی دانید؟! خُب کنار بکشید و نظاره گر شاخه و شانه کشیدن عده ای دیگر از علم دوستان باشید. اکنون وقت آن فرا رسیده که کاربلدهای حوزه بیو وارد میدان شده و تکلیف ماجرا را روشن کنند. اگر جزء این دسته از افراد باشید، خوب می دانید که روش Live/Dead Staining  برای تشخیص سلول های زنده و سلول های مرده مورد استفاده قرار می گیرد. ماجرا کم کم دارد جالب می شود و این جذابیت در پایان مقاله به اوج خود می رسد. پس توصیه می کنیم که تیترها را یکی پس از دیگری مطالعه کرده و این مطلب داغ را به هیچ قیمتی از دست ندهید. قبول؟!

رنگ آمیزی اختصاصی سلول ها (Live/Dead staining) با هدف تشخیص تمایز!

رنگ آمیزی اختصاصی سلول ها با هدف تشخیص تمایز یا به اصطلاح لاکچری تر Live/Dead Staining یکی از دقیق ترین و کارآمدترین روش های تشخیص تغییرات سلولی است. تغییراتی از قبیل عملکرد، شکل، ساختار و حتی تولید بیومولکولی را از طریق روش Live/Dead Staining می توان خیلی ساده و سریع و بدون کوچکترین دردسری تشخیص داد. شما می توانید این تکنیک را از دو طریق پیاده سازی کنید؛ یا با استفاده از رنگ هایی با شناسایی و اتصال اختصاصی و یا از طریق آنتی بادی ها!

شاید این سوال ذهنتان را به خود مشغول کرده باشد که آیا هدف از به کارگیری روشLive/Dead Staining تنها شناسایی سلول های زنده و مرده است؟! این همه زحمت می کشیم و به این در و آن در می زنیم تا فقط همین یک نتیجه دستگیرمان شود؟!

خیر، این گونه نیست. تنها دستاورد روش Live/Dead Staining تشخیص سلول های زنده و مرده نبوده و این تکنیک حرف های زیادی در زمینه های زیر برای گفتن دارد:

• تشخیص مارکرهای سلولی برای تمایز
• بررسی ساختار
• شکست اسیدهای نوکلئیک
• …

یادآوری

هنگامی که تعدادی سلول را در آزمایشگاه کشت کرده و به ناگاه با تمایز سلول های تحت کشت مواجه می شوید، باید یک اصل مهم را به خودتان یادآور شوید و آن این است که:

در اکثر قریب به اتفاق این دسته از موارد، مشخصات ژنوتیپی سلول ها ثابت مانده و آنچه تغییر می کند، مشخصات فنوتیپی آن ها است. به عبارت ساده تر سلول های بنیادی از نظر عملکرد کاملا خام هستند. این دسته از سلول ها از منظر بیان ژن، برای ژن های عملکردی بافت های گوناگون از رویه معینی پیروی نمی کنند. گفتنی است که ژن های مذکور از نظر اپی ژنتیکی قفل نشده اند؛ از همین رو امکان بیان برای آن ها فراهم می باشد.

شاید گردنتان را کج کرده و بگویید متاسفانه به خاطر ندارم که منظور از کشت سلولی چیست!

محض یادآوری می گوییم که کشت سلولی فرآیند جداسازی سلول از بدن جاندار زنده پرسلولی و انتقال آن به یک محیط مصنوعی جدید در آزمایشگاه است. هدف از این کار، مطالعه و بررسی رفتار و کردار سلول ها برای پی بردن به نتایج به دردبخوری است که محققان بهتر از ما در جریانش هستند!

خب برگردیم سراغ اصل مطلب Live/Dead Staining.

اوضاع پس از تمایز چگونه خواهد بود؟!

پس از وقوع تمایز تعداد قابل توجهی از بخش های تواتر ژنی قفل شده و آن دسته از بخش هایی که فعالند، بیان می گردند. با افزایش سطح بیان ژن، تغییرات بزرگی در سلول رخ می دهد که از جمله مهم ترین آن ها می توان به تغییر در شکل، ساختار و عملکرد سلول اشاره نمود.

با شناسایی تغییراتی که پس از تمایز اتفاق می افتد، می توانید ترتیبی بدهید که یک رنگ مشخص برای مثال رنگ قرمز این دسته از تغییرات را عیان کند. اگر شرایط استفاده از رنگ های اختصاصی را ندارید، بروید سراغ آنتی بادی هایی که به مارکرهای پدید آمده در اثر تغییر و تحولات انجام شده، وصل می گردند. یکی از بهترین و کارآمدترین روش های تشخیصی، تشخیص بر مبنای آنزیم های تخصصی بافت ها است. سلول ها طبیعتا برای آن که بتوانند یک عملکرد ویژه را از خود به نمایش بگذارند، چاره ای جز کسب آنزیم های اختصاصی آن عملکرد ندارند.

روش های متعدد و متنوع بسیاری وجود دارند که در دسته روش های Live/Dead Staining قرار می گیرند. در ادامه برخی معروف ترین روش های Live/Dead Staining را معرفی و به اختصار مورد بحث و بررسی قرار می دهیم.

رنگ آمیزی آلیزارین رد

آلیزارین رد یکی از کارآمدترین روش های Live/Dead Staining محسوب می شود که به طور گسترده در بافت شناسی و زیست شناسی سلولی مورد استفاده قرار می گیرد. این ترکیب قرمز- قهوه ای که به عنوان رنگ اختصاصی رنگ آمیزی سلول ها به کار گرفته می شود، نتایج بسیار دقیقی ارائه می دهد. آلیزارین رد استفاده شده در این تکنیک به رسوبات کلسیم وصل شده و در بافت هایی نظیر استخوان، دندان و غضروف رنگ آمیزی سلولی را انجام می دهد. در این روش رنگ آمیزی، آلیزارین رد پس از اتصال به تجمعات کلسیمی در زیر میکروسکوپ به شکل دانه هایی نارنجی- قرمز مشاهده می شود. لازم به ذکر است که استفاده از این روش در بررسی تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به استخوان بسیار مرسوم می باشد. تشخیص سلول های زنده و مرده از دیگر کاربردهای مهم این تکنیک محسوب می شود.

رنگ آمیزی پریودیک اسید- شیف

به عنوان یکی از رایج ترین روش های Live/Dead Staining می توان به روش پریودیک اسید- شیف اشاره کرد. استفاده از این تکنیک که جزء رایج ترین تکنیک های رنگ آمیزی در بیوشیمی، زیست سلولی و هیستولوژی محسوب می شود، در زمینه های زیر متداول است:

• رنگ آمیزی سلول یا بافت به منظور تشخیص و تصویربرداری از پلیمرهای کربوهیدرات
• تشخیص و مطالعه بیماری های گوناگون علی الخصوص اختلالات گلیکوکالیکس
• بررسی های تخصصی تمایز سلول های بنیادی به کراتینوسیت
• تشخیص شکل نسبی تمایز سلول ها به کراتینوسیت
• تشخیص محل حضور سلول ها
• تشخیص سلول های زنده و مرده
• …

آزمایش سلول های زنده و مرده Live/Dead staining

آزمایش سلول های زنده و مرده همان طور که از نامش پیداست، به منظور تشخیص سلول های زنده و مرده با استفاده از روش تشخیصی فلورسنت مورد استفاده قرار می گیرد. محلول رنگ آمیزی Live/Dead ترکیبی متشکل از دو رنگ فلورسنت برای تمایز میان سلول های زنده و مرده است. در این آزمایش سلول های زنده و سالم به رنگ سبز در می آیند. این در حالی است که سلول های مرده و سلول های دارای غشای پلاسمایی آسیب دیده قرمز رنگ می شوند. بدین ترتیب می توان به تشخیص سلول های زنده و مرده پرداخت و نتایج حاصل را در تحقیقات مختلف مورد استفاده قرار داد.

اگر جویای میزان سختی پروتکل تشخیص سلول زنده و مرده هستید، باید بگوییم که این آزمایش طی یک مرحله انجام شده و بسیار ساده تر از چیزی است که فکرش را می کنید.

شاید این سوال ذهنتان را به خود مشغول کرده باشد که محلول Live/Dead چگونه می تواند باعث تمایز سلول های باکتریایی زنده و مرده موجود در یک نمونه گردد؟!

جالب است بدانید که همه چیز به سالم بودن یا نبودن غشای سیتوپلاسمی سلول بر می گردد. همان طور که پیش تر نیز اشاره کردیم، یک رنگ سبز و یک رنگ قرمز به نمونه مورد نظر اضافه می شود. رنگ سبز بدون آن که به زنده یا مرده بودن سلول ها توجه کند، در تمام آن ها نفوذ می نماید. این در حالی است که رنگ قرمز چنین نبوده و از آنجا که حاوی یدید پروپیدیوم است، تنها به سلول های مرده ای که غشای سلولی آن ها دست نخورده نیست، نفوذ می کند. آن دسته از سلول هایی که رنگ سبز را حفظ می کنند و در زیر میکروسکوپ به این رنگ دیده می شوند، ثابت می کنند که زنده اند. سلول های قرمز رنگ نیز جزء سلول های مرده محسوب می شوند. به همین سادگی!