بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT و هر آنچه در این باره نمی دانید!

تست بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT یکی از مشهورترین تست های دنیاست که آزمایشگاه داران و آزمایش دوستان به خوبی با آن آشنا هستند. نمی دانیم اطلاعات شما در مورد این تست کاربردی چقدر است؛ سیر تا پیازش را از بَرید یا نامش را هم نشنیده اید. ما فرض را بر این می گذاریم که چیزی در مورد تست MTT نمی دانید و از کاربردهای اعجاب انگیزش بی خبرید. از همین رو بساط آشنایی با آن را چیده و کلی مطلب مهم برایتان گردآوری کرده ایم؛ مطالبی که مثل و مانندشان را جز در این جا، در هیچ جای دیگر نخواهید یافت. این شما و این هم داغ ترین مقاله درباره تست بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT!

زنده مانی سلول به چه معناست؟!

زنده مانی سلول که کاربلدهای حوزه آزمایشگاه از آن تحت عنوان Cell Viability یاد می کنند؛ به معنای بررسی تعداد سلول های سالم موجود در یک نمونه آزمایشگاهی می باشد. شاید برایتان جالب باشد بدانید که محققان علاقه عجیبی به شمارش کل سلول های یک نمونه و همچنین؛ تعیین تعداد سلول های زنده در برابر سلول های مرده آن دارند. حتما می پرسید مگر دانشمندان بیکارند که کلی وقت می گذارند و سلول های زنده و مرده را می شمارند؟ سلول های مرده را خدا بیامرزد و سلول های زنده نیز به زندگیشان ادامه دهند. شمارش دیگر برای چیست؟!

خوب است بدانید که دانشمندان از طریق شمارش کل سلول ها، سلول های زنده و سلول های مرده به تعیین زیست توده باکتریایی می پردازند. این موضوع که ممکن است از دید شما خیلی سطحی و بیهوده به نظر برسد، یک شاخص حیاتی برای درک موارد زیر محسوب می گردد:

درک مکانیزم عملکرد ژن ها
درک مکانیزم عملکرد پروتئین ها
درک مسیرهای دخیل در بقا یا مرگ سلول پس از قرارگیری آن در مجاورت عوامل سمی

سمیت سلولی به چه معناست؟!

در این که تعداد قابل توجهی از مواد دارای اثر سمی هستند، نه ما شک داریم و نه شما. بدیهی است که برخی از این مواد سمی تر از بقیه اند و از همین رو شناخت آن ها برای دانشمندان و متخصصان پزشکی ضروری است. آن ها می خواهند بدانند کدام مواد سمی هستند، اثر هر یک از آن ها به چه صورت است و میزان تاثیر شدید آن ها بر یک ارگانیسم به چه شکل است؟

اگر بخواهیم خیلی ساده و صریح خدمتتان عرض کنیم، سمیت به کیفیت سمی یا اصطلاحا سمی بودن یک ماده نظیر یک دارو اطلاق می گردد. این نکته را هم مد نظر داشته باشید که سمیت یک ماده به دوز آن بستگی دارد. گاهی دوز پایین است و اثرات نامطلوب کمتر، گاهی بالا و اثرات نامطلوب شدیدتر!

نظر شما محترم!

به نظر شما اگر سمیت را به عنوان یک اصطلاح جامع تر؛ مضر بودن یک ماده در یک ارگانیسم تعریف کنیم، اشتباه کرده ایم؟!

مسلما خیر. بر این اساس می توان سمیت سلولی را در یک عبارت مفید و در عین حال مختصر، سمی بودن یک ماده برای سلول ها عنوان کرد. سمی بودن یک ماده می تواند موجبات آسیب یا مرگ سلولی را فراهم سازد. برای مثال یک ترکیب سیتوتوکیسک می تواند باعث بروز نکروز یا آپوپتوز شده و ورود آسیب به سلول یا مرگ آن را در پی داشته باشد.

اصلی ترین هدفی که دانشمندان برای تحقق آن تلاش می کنند، اندازه گیری سطح سمیت سلولی یک ماده شیمیایی است. آن ها می خواهند اطمینان حاصل نمایند که این مواد برای بیماران مضر نبوده و کشنده نیستند. تست بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT یکی از روش های مطمئنی است که دستیابی به این هدف را ساده تر می سازد.

در مورد زنده مانی سلول ها صحبت کردیم و کم و بیش با سمیت سلولی آشنا شدیم. اکنون که الفبای تست بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT را آموخته ایم، وقت آن فرا رسیده که به بحث درباره ماهیت آن بپردازیم. تا پایان همراهمان باشید که ماجرا تازه از این به بعد هیجان انگیزتر می شود!

آشنایی با تست بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT

گفتنی است که بررسی زنده مانی سلول ها و اندازه گیری میزان سمیت آن ها از روش های مختلفی امکان پذیر است. دانشمندان با توجه به شرایط، علایق و سلایق خود یکی از این روش ها را برگزیده و از طریق آن کاروبارشان را انجام می دهند. برای مثال برخی از این تکنیک ها به اندازه گیری میزان فعالیت یک آنزیم درون سلولی در سلول زنده می پردازند. سپس از آن طریق به بحث زنده مانی و سمیت سلولی وارد شده و ادامه داستان…

یکی از متداول ترین روش های بررسی زنده مانی و سمیت سلولی که بسیاری از دانشمندان ثابت کرده اند عاشقش هستند، تست رنگ سنجی MTT است. اختصار MTT را از عبارتی به معنای دی متیل تیازول 2 و 5 دی فنیل تترازولیوم برمید برگرفته اند.

تست MTT که مثل توپ در میان دانشمندان و محققان ترکیده و سروصدا به پا کرده، یکی از بهترین تکنیک های رنگ شناسی است که مرگ سلول ها را تخمین زده و از این طریق میزان زنده مانی آن ها را می سنجد. مگر می شود از طریق رنگ ها فهمید که یک سلول زنده است یا نه؟!

در دنیای بی انتهای علم هیچ چیز غیر ممکنی وجود ندارد. بررسی زنده مانی و میزان سمیت سلول ها از روی رنگ که جای خود دارد!

تست بررسی زنده مانی و سمیت سلول شامل سه مرحله اصلی تحت عناوین Seeding، Treatment و MTT است که انجام هر یک از آن ها نیازمند یک روز زمان می‌باشد. بین مرحله Treatment و MTT نیز با در نظر گرفتن نوع سلول ها و داروی مورد نظر حدود 24، 48 یا 72 ساعت فاصله می اندازند.

شرح آزمایش بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT

اگر آزمایش را به صورت پیوسته بر روی سلول هایی که به پلیت چسبیده اند، انجام می دهید؛ نخست لازم است که تعداد مناسبی از سلول ها را انتخاب کنید. سپس سلول های انتخابی را در هر یک از چاهک ها کاشته و 24 ساعت به آن ها فرصت دهید که به کف پلیت بچسبند و به پایداری برسند.

حال وقت انتخاب چاهک های کنترل و آزمایش است. پس از انجام این انتخاب سرنوشت ساز، مقدار کافی از میتوژن یا داروی مورد نظر را برداشته و آن را به چاهک های انتخابی می افزاییم. سپس پلیت را داخل انکوباتور گذاشته و زمان مشخصی به آن فرصت می دهیم تا میتوژن یا داروی استفاده شده، بر روی سلول های موجود در داخل چاهک ها اثر کند.

پس از این که زمان انکوباسیون به پایان رسید، محیط کشت رویی را دور ریخته و سپس به هر یک از چاهک ها مقداری محلول MTT اضافه می کنیم. چقدر؟!

به اندازه 200 میکرولیتر محیط کشت حاوی نیم میلی گرم در میلی لیتر. پس از افزودن این مقدار محلول MTT به چاهک ها، مجددا پلیت را برای مدت زمان 2 الی 4 ساعت داخل انکوباتور دی اکسید کربن با دمای 37 درجه سانتی گراد می گذاریم. در این مدت عمل احیا انکوباسیون MTT از طریق سیستم سوکسینات دهیدروژناز صورت می پذیرد. لازم است بدانید که سوکسینات دهیدروژناز یکی از اصلی ترین آنزیم های چرخه تنفسی میتوکندری ها می باشد. هنگامی که این حلقه احیا و شکسته می شود، کریستال های بنفش- آبی فورمازان تولید می گردند. این کریستال ها اگرچه با چشم قابل تشخیص نیستند، اما با استفاده از میکروسکوپ به خوبی قابل مشاهده اند. جالب و در عین حال لازم است بدانید که رابطه میان میزان رنگ تولید شده در این مرحله و شمار سلول های زنده مستقیم است.

بررسی زنده مانی سلول با استفاده از تست MTT

ناگفته های تست بررسی زنده مانی و سمیت سلولی MTT را باید گفت…

یکی از مهم ترین ویژگی های کریستال های فورمازان عدم انحلال پذیری آن ها در آب است. از همین رو لازم است پیش از شروع فرآیند رنگ سنجی، این کریستال ها را با حلالی نظیر دی متیل سولفوکساید ترکیب نمایید تا به حالت محلول درآیند. جذب نوری محلول نهایی ای که از این طریق به دست می آید، در طول موج 570 نانومتر در نظر گرفته شده و تفسیر آن از طریق منحنی استاندارد داده ها صورت می پذیرد. برای هر تیره سلولی که مد نظر شماست، یک ارتباط خطی میان تعداد سلول ها و جذب نوری محلول نهایی وجود دارد. از همین رو لازم است که برای هر تیره سلولی اقدام به رسم منحنی استاندارد مربوط به همان تیره نموده و به تفسیر آن بپردازید.