همه چیز درباره استخراج RNA از بافت و سلول

اگر کم و بیش از زیست شناسی مولکولی سر در بیاورید، حتما می دانید که استخراج RNA، DNA و پروتئین اساسی ترین و پایه ای ترین تکنیک های موجود در این شاخه زیست شناسی محسوب می شوند. محققان این بیومارکرها را از نمونه های بیولوژیکی جداسازی نموده و آن ها را در راستای تحقق اهداف گوناگون تحقیقاتی و تشخیصی و نیز درمان بیماری ها، مورد استفاده قرار می دهند. پس بر شما واجب است که از اسرار استخراج RNA سر در بیاورید و با روش ها و چگونگی انجام این کار آشنا شوید. برای یادگیری یک مطلب جانانه آماده اید؟!

استخراج RNA به چه معناست؟

به فرآیند جداسازی و خالص سازی RNA از نمونه های بیولوژیکی گوناگون نظیر بافت، سلول، خون، مایعات بدن و… استخراج RNA گفته می شود. کیفیت و کمیت RNA استخراجی در طی این فرآیند یکی از مهم ترین فاکتورهایی است که در راستای حصول اطمینان از صحت آنالیز بیان ژن و سایر کاربردها مورد استفاده قرار می گیرد.

اگر فکر می کنید استخراج RNA پروسه ای ساده است و خیلی راحت و بی دردسر انجام می شود، سخت در اشتباهید. آنزیم ریبونوکلئاز که به وفور در بافت ها و سلول های بدن یافت می شود، یکی از بزرگترین موانع موجود بر سر راه این نوع استخراج محسوب می گردد. چرا که آنزیم مذکور در چشم به هم زدنی RNAهای تک رشته ای را تجزیه کرده و بدین ترتیب؛ عمل استخراج را با مشکل مواجه می سازد.

نحوه انجام استخراج RNA

شاید با خودتان چنین بیندیشید که روش های استخراج RNA درست همان روش هایی هستند که در زمینه استخراج DNA مورد استفاده قرار می گیرند. اما حقیقت چیزی جز این است و با روش های استخراج DNA نمی توانید RNA استخراج کنید. می پرسید چرا؟!

چون ساختار RNA از زمین تا آسمان با ساختار DNA فرق می کند. برای مثال DNA یک مولکول زیستی دو رشته ای است، در حالی که RNA جزء مولکول های زیستی تک رشته ای محسوب می شود. حساسیت DNA نسبت به عوامل محیطی گوناگون اعم از دما و ریبونوکلئازها بیشتر از حساسیتی است که RNA در مقابل این موارد از خود به نمایش می گذارد. تمام این موارد دست به دست هم داده و زمینه ای را فراهم ساخته اند که مراحل استخراج RNA تحت شرایط ویژه امکان پذیر باشد. پس اگر از استخراج DNA سر در می آورید، ادعا نکنید که استاد استخراج RNA هستید. یک بار گفتیم، باز هم می گوییم؛ این دو بسیار متفاوت تر از چیزی هستند که فکرش را می کنید. پس لطفا قیمه ها را قاطی ماست ها نکنید!

یکسان با اندکی متفاوت…

پروتکل هایی که در جهت استخراج RNA از نمونه های زیستی به کار گرفته می شوند، تقریبا یکسانند. آنچه باعث ایجاد تفاوت های جزئی میان این پروتکل ها شده، نوع نمونه هدف است. برای مثال اگر بخواهید RNA را از بافت استخراج نمایید؛ می بایست مراحلی بیشتری نسبت به استخراج RNA از سلول طی کنید. چرا که در استخراج این مولکول های زیستی از بافت، لازم است چند مرحله آماده سازی روی نمونه بافتی انجام شود. به عنوان نمونه ای دیگر از تفاوت های موجود میان نوع نمونه هدف که به ایجاد تفاوت میان پروتکل های استخراج می انجامد؛ می توان به استخراج RNA از سلول های عصبی و بافت مغز اشاره کرد. جالب و در عین حال لازم است بدانید که بافت مغز بافتی سرشار از لیپید است. از همین رو استخراج RNA با کیفیت از آن دشوار می باشد.

برای آن که RNA استخراج شده باکیفیت بوده و از درصد خلوص بالایی برخوردار باشد، رعایت چند فاکتور مهم الزامی است. یکی از مهم ترین این فاکتورها عاری بودن RNA استخراجی از آلودگی های مختلف نظیر پروتئین، DNA ژنومی، بازدارنده های سنتز CDNA مانند فنل، اتانول و کلروفرم است. یکی دیگر از حائز اهمیت ترین نکاتی که توجه به آن ضروری است، عدم وجود نوکلئازها در RNA استخراجی می باشد. در غیر این صورت RNA به دست آمده تجزیه شده و از بین می رود.

واکنش هایی نظیر واکنش PCR و سایر تکنیک های مولکولی به طرز قابل توجهی از مراحل استخراج RNA و حضور آلودگی های گوناگون همچون چربی، هموگلوبین و… تاثیر می پذیرند. این موضوع موجب شده که ستاپ پروتکل استخراج RNA از بافت و سلول تا حد غیر قابل انکاری در روند کسب نتایج حائز اهمیت باشد.

معرفی روش های استخراج RNA از بافت و سلول

به منظور استخراج RNA از بافت و سلول از سه تکنیک اساسی که در ادامه آن ها را معرفی و به اختصار مورد بررسی قرار می دهیم؛ استفاده می کنند.

استخراج RNA بر اساس کلروفرم- فنل

متداول ترین روشی که به منظور استخراج RNA از بافت و سلول مورد استفاده قرار می گیرد، استخراج مایع- مایع بر اساس کلروفرم- فنل است. جالب و در عین حال لازم است بدانید که اساس کار اکثر قریب به اتفاق کیت های استخراج RNA همین روش می باشد.

روش استخراج بر اساس کلروفرم- فنل درست مانند سایر روش هایی که در این زمینه به کار گرفته می شوند، دارای مزایا و معایبی است که چشمپوشی از آن ها غیرممکن است. بزرگترین ایرادی که این روش کاربردی به همراه دارد؛ آلودگی با اجزای سلولی و سایر حلال هاست. همچنین برای پیاده سازی این روش، رعایت شرایط محافظتی استاندارد آزمایشگاهی نظیر دسترسی به هود شیمیایی الزامی است. حتما می خواهید بگویید این روش مزیت ندارد؟!

دست نگه دارید؛ دارد. اصلی ترین مزیت روش استخراج RNA بر اساس کلروفرم- فنل، تجربه استخراجی با کیفیت و کمیت بالا است. ستاپ کردن ساده و بی دردسر این تکنیک یکی دیگر از مهم ترین مزایای آن محسوب می شود.

استخراج RNA به روش ستون چرخشی مبنی بر غشای سیلیکا

برای استخراج RNA به روش ستون چرخشی مبنی بر غشای سیلیکا احتیاجی به حلال های سمی نخواهید داشت. میزان آلودگی RNA با سایر اجزای نمونه هدف در این روش بسیار کمتر از دیگر روش های موجود در این زمینه می باشد. این ستون های چرخشی که در راستای خالص سازی نوکلئیک اسید مورد استفاده قرار می گیرند، شامل رزین سیلیکای متصل به RNA هستند. در صورتی که PH پایین باشد، مولکول های زیستی RNA به صورت اختصاصی به غشای سیلیکا وصل می گردند. در این شرایط پروتئین ها و پلی ساکاریدها قادر به عبور از این مولکول ها خواهند بود. پس از این مرحله ناخالصی های موجود، از طریق شستشو حذف شده و در نهایت در شرایط نمکی پایین؛ مولکول های RNA از غشا جداسازی گشته و مولکول هایی قابل نگهداری تبدیل می شوند.

استخراج RNA با به کارگیری ذرات مغناطیسی

اگر بگوییم استخراج RNA با به کارگیری ذرات مغناطیسی یکی از ساده ترین و در عین حال کارآمدترین روش های استخراج این مولکول زیستی است، نه اغراق کرده ایم و نه گزاف گفته ایم. در حال حاضر شما می توانید به بازار مراجعه کرده و بسیاری از حامل های مغناطیسی را به صورت تعبیه شده در کیت های تجاری خریداری نمایید. حامل های مغناطیسی ای که از لیگاندهای تهیه شده از پلیمرهای زیستی دارای میل ترکیبی به اسیدهای نوکلئیک هدف ساخته شده اند؛ در فرآیند جداسازی به کار گرفته می شوند. با استفاده از بید مغناطیسی که لاکچری تر ها از آن تحت عنوان بید مگنتی یاد می کنند، می توانید به استخراج RNA از نمونه های مختلف نظیر خون، باکتری، ویروس و… بپردازید. این بیدها که سطحشان را مواد باردار پوشانده اند، ابعادی بسیار کوچک داشته و این قابلیت را دارند که به RNAها وصل گردند.

زمانی که بیدهای مگنتی را به نمونه بیولوژیکی مورد نظر می افزایید، اجزای سلولی لیز شده از میدان مغناطیسی عبور نموده و جذب قطبین می گردند. در نتیجه این عمل سایر اجزای سلول از RNA جدا شده و RNAهای وصل شده به بیدهای مگنتی را در بافرهای نمکی می گذارند. بدین ترتیب اتصال میان RNAها و بیدها از بین می رود.

جالب است بدانید که درصد خلوص RNA استخراجی از طریق این روش بسیار بالاتر از چیزی است که فکر می کنید. پس جای تعجب نیست اگر بگوییم که هزینه این روش استخراج RNA بسیار بالاست. آنقدر بالا که این روش هنوز که هنوز است به روشی روتین برای استفاده در آزمایشگاه های معمولی تبدیل نشده است!