تکنیک SDS-Page و هر آنچه لازم است درباره آن بدانید!
تکنیک SDS-Page با نام حوصله سَر بَر سدیم دودسیل سولفات- پلی آکریل آمید الکتروفورز ژل، یکی از سرشناس ترین سیستم های الکتروفورتیک ناپیوسته ای است که می‌توانیم خدمتتان معرفی کنیم. این تکنیک که زحمت توسعه آن را جناب Ulrich K. Laemmli کشیده، روشی دقیق برای جداسازی پروتئین هایی است که از جرم مولکولی بین 5 تا 250 کیلو دالتون برخوردارند. هنگامی که سدیم دودسیل سولفات و ژل پلی آکریل آمید به صورت ترکیبی استفاده می شوند، زمینه از بین رفتن اثرات بار و ساختار را فراهم می سازند. بدین ترتیب یک معیار برای جداسازی پروتئین ها باقی می ماند و آن چیزی نیست جز تفاوت در وزن مولکولی!
سردرگم شده اید؟! نمی دانید ماجرا از چه قرار است، اما دوست دارید از قضیه سر در بیاورید؟! با دیدن نام بلند بالای سدیم دودسیل سولفات- پلی آکریل آمید الکتروفورز ژل گُرخیده اید، با این حال چاره ای جز آشنایی با آن ندارید؟!
اگر چنین است، باید بگوییم که ترس و استرستان بیهوده است. کمی که بحث را بازتر کنیم، از سردرگمی نجات پیدا کرده و سرنخ ها را یکی پس از دیگری در دست می گیرید. تا اطلاع ثانوی هم به جای سدیم دودسیل سولفات- پلی آکریل آمید الکتروفورز ژل، بگویید SDS-Page تا از سطح هورمون کورتیزول خونتان کاسته شده و به شرایط عادی برگردید!
آشنایی با تکنیک SDS-Page
تکنیک SDS-Page یکی از کارآمدترین روش های الکتروفورز محسوب می شود که به جداسازی پروتئین ها بر اساس جرم آن ها می پردازد. محیط رخداد این فرآیند که از آن تحت عنوان ماتریکس نیز یاد می کنند، یک ژل ناپیوسته مبتنی بر پلی آکریل آمید می باشد. این ژل را غالبا بین دو صفحه شیشه ای موجود در یک ژل دال تعبیه می کنند. ژل های لوله ایِ قرار گرفته در استوانه های شیشه ای را می توان در طول تاریخ استفاده کرد. این در حالی است که ژل های اسلب که به محض روی کار آمدن، ژل های لوله ای را منسوخ نمودند؛ چنین نیستند. به علاوه در ساخت این ژل ها از سدیم دودسیل سولفات یا به اختصار SDS استفاده می شود.
استفاده از تکنیک SDS-Page علاوه بر تفکیک و مطالعه پروتئین ها، در زمینه بررسی RNA و DNA نیز مرسوم می باشد. در این روش نمونه های مورد نظر برای تحقیق و آزمایش را در چاهک هایی تزریق می کنند. از آن جا که بار این نمونه ها منفی است؛ بر اساس اصل معروف “بارهای ناهمنام یکدیگر را جذب می کنند”، به سمت الکترودهای مثبت به حرکت در می آیند. در این میان پروتئین هایی که کوچکتر هستند، از پروتئین های بزرگتر سبقت گرفته و سریع تر از ژل عبور می نمایند. این گونه است که تفکیک پروتئین ها بر اساس ابعاد و وزن مولکولی آن ها صورت می پذیرد.
در مورد دی ان ای نیز باید خدمتتان عرض کنیم که در روش SDS-Page، تکه های این ماکرومولکول دو رشته ای نیز بر اساس ابعادشان جداسازی می شوند. جالب است بدانید که از این طریق می توان خیلی ساده و سریع میزان موفقیت فرآیند PCR را اندازه گیری کرد.
آشنایی با مراحل تکنیک SDS-Page
به عنوان یک جمع بندی مختصر و مفید باید بگوییم که تکنیک SDS-Page روشی مقرون به صرفه، سریع و تکرارپذیر برای مطالعه پروتئین ها است. این روش با استفاده از دستگاهی تحت عنوان الکتروفورز پیاده سازی می شود. حضور سدیم دودسیل سولفات و ژل پلی آکریل آمید در این روش، زمینه ای را فراهم ساخته که پروتئین ها با قدرتی غیر قابل باور تفکیک گردند. SDS نوعی دترجنت آنیونی است که به نواحی آب گریز پروتئین ها وصل می شود و موجبات دناتوره شدن آن ها را مهیا می سازد. به عبارت ساده تر؛ هنگامی که مولکول های SDS به پروتئین ها وصل می شوند، توسط پروتئین ها پوشیده شده و بدین ترتیب توزیعی یکنواخت از بارهای منفی بر روی آن ها ایجاد می گردد. بر اثر این اتفاق به ظاهر ساده، مولکول های پروتئین بر اساس وزن مولکولی جداسازی می گردند.
با هدف خطی کردن مولکول های پروتئین، آن ها را در مقدار معینی سدیم دودسیل سولفات و مرکاپتواتانول که نوعی ماده احیا کننده است، قرار می دهند. با این کار باندهای دی سولفیدی از بین خواهند رفت. مقدار سدیم دودسیل سولفات یا به اصطلاح SDS مورد نیاز به ازای هر گرم پروتئین، 4/1 گرم می باشد. این مقدار SDS به هر گرم پروتئین متصل شده، سپس دستگاه راه اندازی گشته و جداسازی پروتئین ها با توجه به وزن مولکولی آن ها صورت می پذیرد. هرچه مولکول پروتئین از ابعاد بزرگتری برخوردار باشد، اصطکاک آن با محیط اطراف بیشتر و در نتیجه حرکت آن کمتر خواهد بود. این در حالی است که پروتئین های کوچکتر خیلی سریع به حرکت درآمده و از همنوعان بزرگتر خود فاصله می گیرند.
نکته جالب!
جالب است بدانید که خاص بودن ساختار SDSها اتصال آن ها به قندها را ناممکن ساخته است. این موضوع موجب شده که پروتئین های دارای بخش قندی بزرگتر، با توجه به وزن مولکولی خود سدیم دودسیل سولفات کمتری جذب کرده و به همین دلیل با سرعت آهسته تری بر روی ژل به حرکت در آیند. در چنین شرایطی تخمین وزنی این دسته از پروتئین ها از وزن واقعی آن ها بیشتر خواهد بود.
تکنیک SDS-Page نیز درست مانند هر تکنیک دیگری از مراحل متعدد و متنوعی تشکیل شده است. این مراحل عبارتند از:
- تولید ژل
- آماده سازی نمونه
- الکتروفورز
- رنگ آمیزی پروتئین یا وسترن بلات
- تحلیل و بررسی الگوی باندینگ
- آرشیو کردن
لازم به ذکر است که مرحله آماده سازی نمونه، خود از زیر مرحله های مختلفی تشکیل شده که به قرار زیرند:
- اضافه نمودن بافر نمونه با نسبت معین یک به سه به پروتئین
- استقرار بافر نمونه در آب جوش به مدت چند دقیقه
- قرارگیری نمونه در ته چاهک به علت وجود ساکارز و گلیسرول
نقش ژل پلی آکریل آمید در تکنیک SDS-Page چیست؟
در تکنیک SDS-Page که با استفاده از دستگاه الکتروفورز پیاده سازی می شود، ژل پلی آکریل آمید نقشی بسیار تعیین کننده و سرنوشت ساز در جداسازی پروتئین ها بر اساس جرم مولکولی آن ها دارد. گفتنی است که آنچه باعث تعیین دامنه وزنی قابل تفکیک در این تکنیک می شود، قطر منافذ موجود در ژل می باشد.
یکی از داغ ترین مباحثی که این روزها نقل محافل علمی شده، تکنیک SDS-Page در شرایط احیایی و غیر احیایی است. مایلید به اتفاق کمی در این باره صحبت کنیم؟!
بررسی تکنیک در شرایط احیایی و غیر احیایی
پیوندهای دی سولفیدی درون و بین زنجیره ای پروتئین نقش مهم و غیر قابل انکاری در شکل گیری ساختمان های سوم و چهارم پروتئین ها دارند. در صورت احیای این پیوندها با مواد تیول دار، ساختمان های سوم و چهارم مولکول های پروتئین کاملا از بین می روند.
حرکت پروتئین های دارای پیوند دی سولفید در شرایط احیایی و غیر احیایی دستگاه الکتروفورز متفاوت می باشد. احیای پیوندهای دی سولفیدی موجبات جداسازی زیرواحدهای پروتئینی در پروتئین را فراهم می سازد. علاوه بر این، این امر باعث خطی شدن کلیه پروتئین ها می شود. لازم به ذکر است که خطی شدن پروتئین ها باعث می شود که اس دی اس ها و پروتئین ها به صورت کاملا یکنواخت به یکدیگر وصل گردند. با این اوصاف مطالعه و مقایسه الگوی الکتروفورز در شرایط احیایی و غیر احیایی اطلاعات به دردبخور بسیاری را در مورد ساختار سوم پروتئین ها در اختیار دانشمندان و محققان قرار می دهد.
کاربرد SDS-Page در پزشکی
کاربرد SDS-Page در پزشکی بسیار گسترده تر از چیزی است که فکرش را می کنید. این تکنیک به وفور در راستای ارزیابی Proteinuria و بخش هایی از آزمایش اچ آی وی مورد استفاده قرار می گیرد. در آزمایش HIV که نتیجه آن تعیین کننده بیماری ایدز است، پروتئین های HIV توسط تکنیک نام برده جداسازی شده و در صورت وجود در سرم خون بیمار، به وسیله وسترن بلات ها یا آنتی بادی های اختصاصی شناسایی می گردند. این تکنیک همچنین با شناسایی سطح پروتئین های مختلف در نمونه ادرار به ارزیابی Proteinuria می پردازد.
