صفر تا صد طراحی siRNA

طراحی siRNA یکی از جذاب ترین مباحث علم بیو محسوب می شود که تعداد علاقه مندان به یادگیری آن روز به روز در حال افزایش است. به احتمال قریب به یقین شمایی که هم اکنون در حال خواندن این مقاله هستید، به این دسته از افراد تعلق دارید. چرا که بی شک واژه مرتبطی با این موضوع سرچ کرده اید و از همین رو گوگل ترجیح داده که شما را به سمت جامع ترین مقاله نوشته شده در این زمینه هدایت کند. ضمن خوشامدگویی و تبریک بابت حُسن انتخابتان؛ شما را به مطالعه ادامه مطلب دعوت می کنیم. امید است که مفید واقع شده و گره از کارتان بگشاید!

siRNA چیست؟

siRNA که نام آن را از عبارت Small Interfering RNA به معنای آر ان ای کوچک مداخله گر برگرفته اند، تحت عناوین دیگری همچون آر ان ای کوتاه مداخله گر و آر ان ای خاموش کننده نیز شناخته می شود. این دسته از مولکول های آر ان ای دو رشته ای که از طول 18 الی 21 جفت بازی برخوردار می باشند، درون کمپلکس پروتئینی به نام RISC تعبیه شده و بدین ترتیب موجبات تجزیه mRNA های مکمل خود را فراهم می سازند. در نتیجه این کار، خاموشی ژن ها پس از رونویسی ژن مربوطه رخ می دهد. از این طریق می توان به بررسی عملکرد ژن هدف پرداخت.

البته باید این نکته را مد نظر داشته باشید که کاربرد مولکول های siRNA تنها به کشف عملکرد ژن ها محدود نمی گردد. این روش، روشی نوین برای خاموشی فعالیت بیش از حد ژن ها در درمان بیماری های گوناگون بوده و از همین رو بسیار مورد توجه قرار گرفته است.

siRNAها گاه دارای منشا سلولی یا اصطلاحا اندوژنی هستند. این در حالی است که برخی از این مولکول ها از منشا خارج سلولی یا به اصطلاح اگزوژنی برخوردار می باشند. جالب و در عین حال لازم است بدانید که پیش سازهای داخل سلولی یا اندوژنی از نواحی غنی از تکرار نظیر سانترومرها یا تلومرها نشات می گیرند. اگر جویای منشا پیش سازهای اگزوژنی هستید، باید خدمتتان عرض کنیم که منشا آن ها ژنوم های خارج سلولی یا سازه های حاوی پیش ساز siRNA است. به عنوان نمونه ای بارز از ژنوم های خارج سلولی می توان به ویروس های آلوده کننده سلول اشاره نمود.

مواد لازم برای خاموش کردن یک ژن!

برای خاموش کردن یک ژن، سلول های مورد نظر را مستقیما و با به کارگیری محلول های خاص از طریق siRNA طراحی شده، تیمار می کنند. لازم است بدانید که تیمار سلول ها از این طریق، امکان استفاده موفق از تکنولوژی RANi برای خاموشی ژن ها در سیستم پستانداران را میسر ساخته است. با این حال این روش، روشی غیر دائمی و موقت بوده و فنوتیپ به دست آمده از طریق آن بعد از گذشت چند دور مستقیم از بین می رود. اصلی ترین دلیل این موضوع کاهش غلظت siRNA عنوان شده است.

اگر به دنبال روشی مناسب و موثر برای بررسی های کوتاه مدت هستید، روش فوق الذکر بهترین روشی است که برایتان سراغ داریم. با این حال به هیچ وجه نمی توان این تکنیک را جایگزین تکنیک های Knock-out کرده و یا آن را با هدف انجام بررسی های دقیق مورد استفاده قرار داد. به عنوان یکی دیگر از چشمگیرترین نقاط ضعف این روش می توان به بالا بودن هزینه سنتز siRNA اشاره کرد. شاید این نقطه ضعف از نظر آنان که وضعشان توپ است و دغدغه مالی ندارند، چندان حائز اهمیت به نظر نرسد؛ اما حقیقت این است که فواید این تکنیک را به طور قابل توجهی می کاهد. چاره چیست؟ چه باید کرد؟!

چاره کار ایجاد سیستمی تحت عنوان shRNA برای بیان پایدار siRNA ها است. مایلید به اتفاق با این سیستم آشنا شویم؟!

آشنایی مختصر و مفید با shRNA

اگر از ما بپرسید که بهترین و رایج ترین روش تولید siRNA به صورت پایدار در داخل سلول چیست، با قطعیت می گوییم به کارگیری وکتورهای بیان کننده shRNA. در این تکنیک وکتورهای بیانی با الگوبرداری از ساختار میکرو آر ان ای های طبیعی، طراحی شده و بدین ترتیب؛ زمینه تولید siRNA در سلول را فراهم می سازند. غالبا قطعه ورودی شامل یک توالی نوکلئوتیدی از مکمل هدف می باشد. این قطعه، پس از یک قطعه فاصله دهنده مستقر شده و بعد از آن یک مکمل معکوس توالی هدف می آید. در زمان رونویسی یک ساختار سنجاق سری تحت عنوان shRNA با ساقه bp19 به دست می آید. این ساختار به وسیله DICER به siRNA تبدیل شده و از این طریق به مکانیزم های خاموش کننده توالی هدف راه پیدا می کند.

جالب است بدانید که وکتورهای بیان کننده shRNA دارای مارکرهای انتخابی می باشند. این مارکرها امکان گزینش سلول های آلوده شده را فراهم می سازند. همچنین آن ها از عواملی القایی برخوردارند که تنظیم بیان siRNA ها را ممکن می سازند. اگر بازدهی آلودگی پایین باشد، وکتورهای ویروسی را به منظور ارسال siRNA به سلول طراحی می کنند. وکتورهای لنتی ویروس که اساس تکنیک های ژن درمانی با RNAi محسوب می شوند، به منظور آلوده سازی سلول های زیر مورد استفاده قرار می گیرند:

• سلول های غیر تقسیم شونده
• سلول های بنیادی
• زیگوت ها

اصول طراحی siRNA

اگرچه در تناسب عملکرد siRNA ها در شناسایی عملکردهای ژنتیکی هیچ شکی نیست، اما وجود بعضی محدودیت های ریز و درشت کارایی این روش را به حداقل رسانده اند. طراحی یک توالی siRNA موثر یکی از این محدودیت ها است. باید اطمینان حاصل نماییم که اس آی آر ان ای طراحی شده می تواند در خاموشی بیان و فعالیت یک ژن موثر باشد. بدین منظور لازم است اصول طراحی siRNA را از بَر باشیم تا بتوانیم تا حد قابل توجهی بر کارایی این روش بیفزاییم. برای آشنایی با این اصول کارآمد آماده اید؟!

اصول نُه گانه طراحی

اصل اول: حداکثر طول قطعات می بایست 21 نوکلئوتید باشد، نه بیشتر!

اصل دوم: فاصله ناحیه هدف با کدون های ابتدایی و انتهایی می بایست بین 50 تا 100 bp باشد.

اصل سوم: طراحی نباید در نواحی اینترونی صورت بپذیرد.

اصل چهارم: از هدف قرارگیری نواحی دارای تکرار یا پیچیدگی کم خودداری گردد.

اصل پنجم: مقدار نسبت G+C باید حتما بین 25% الی 30% باشد.

اصل ششم: از انتخاب نواحی SNP به عنوان ناحیه هدف جدا خودداری گردد.

اصل هفتم: ناحیه هدف انتخابی می بایست فاقد همولوژی با نواحی مشابه سایر ژن باشد.

اصل هشتم: ناحیه انتخابی به عنوان ناحیه هدف فاقد ساختمان ثانویه باشد.

اصل نهم: ناحیه انتخابی به عنوان ناحیه هدف به هیچ عنوان محل اتصال پروتئین ها نباشد.

نکته مهم: با طراحی الیگو نوکلئوتیدهای siRNA می توانید بازدهی اثر siRNA ها را تا حد شگفت انگیزی افزایش دهید. اصول کلی طراحی الیگو نوکلئیوتیدها را در تیتر بعدی برایتان آورده ایم!

اصول کلی طراحی الیگو نوکلئوتیدهای siRNA

اصل اول: وجود A/U در آخر 5 رشته Antisense

اصل دوم: وجود حداقل 5 باقی مانده A/U در یک سوم پایانی 5 رشته

اصل سوم: عدم وجود ناحیه ای که مقدار G/C آن بیش از 9 باشد.

اصل چهارم: عدم وجود G در جایگاه سیزدهم

اصل پنجم: عدم وجود G یا C در جایگاه نوزدهم

اصل ششم: حضور 3 یا بیش از 3 باز A/U بین جایگاه سیزدهم تا نوزدهم در توالی رشته Sense

به خاطر داشته باشید که عدم تقارن siRNA باعث تشکیل RISC می شود. توالی هدفی که دارای این خصوصیت باشد، ساختار ثانویه ندارد. سهولت دسترسی به توالی با هدف تشخیص توالی هدف زمینه بهبود موفقیت RNAi را فراهم می سازد. اگر بخواهیم خیلی ساده و سریع و به دور از اصطلاحات پیچیده خدمتتان عرض کنیم، چنین می گوییم:

لازم است که توالی siRNA را باید به گونه ای انتخاب کنید که بین 50 تا 100 نوکلئوتید پایین تر از کدون آغازگر باشد. در عین حال ژن مورد نظر می بایست تنها هدف خاموشی بوده و محتوای G-C نیز بین 25% تا 30% باشد. انجام طراحی بر روی نواحی ساختار ثانویه نیز ممنوع است. با رعایت این نکات ضمن انجام یک طراحی موفقیت آمیز، می توانید به بررسی موضوعات مد نظرتان بپردازید!